易 喻，李慧娟，陳建澍，梅建鳳，朱克寅，應(yīng)國清

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.杭州博林生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 300018）

紙纖維固定木瓜蛋白酶的研究及應(yīng)用

易 喻1，李慧娟1，陳建澍1，梅建鳳1，朱克寅2，應(yīng)國清1

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.杭州博林生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 300018）

利用紙纖維為載體，制備高活性的固定化木瓜蛋白酶并應(yīng)用于抗HCG抗體的水解.利用戊二醛交聯(lián)法，制備固定化木瓜蛋白酶，并通過一系列優(yōu)化，得到最佳固定化條件，包括pH、給酶量、溫度、戊二醛體積分數(shù)，將制備的固定化木瓜蛋白酶應(yīng)用于抗HCG抗體水解并制備F（ab′）2片段.研究表明：反應(yīng)溫度為40℃時，固定化酶在pH 5.0，0.01 mol／L的醋酸緩沖液條件下，給酶量為46 mg／g載體，戊二醛體積分數(shù)為0.01%時，固定化酶的酶活達到最高19 250 U／g，相對于優(yōu)化前1 940 U／g提高了近10倍，成功應(yīng)用于抗HCG抗體水解制備F（ab′）2片段：經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，F(xiàn)（ab′）2片段達到電泳純.ELISA反應(yīng)檢測表明：片段仍保留較高的活性，效價為1∶12 000.

抗 HCG抗體；固定化酶；木瓜蛋白酶；F（ab′）2片段；ELISA；紙纖維

酶作為一種高特異性和高催化活性的蛋白質(zhì)，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、工業(yè)及生物催化領(lǐng)域，但是游離酶液重復(fù)利用性較低，并且很多工業(yè)用酶價格也比較昂貴，從而限制了它的應(yīng)用.酶的固定化便成為酶使用方式的一種有效選擇［1］.將酶固定在非水溶性載體上是目前一種比較有發(fā)展?jié)摿Φ墓潭ɑ绞?，它可以提高酶的熱穩(wěn)定性或者pH的穩(wěn)定性，降低產(chǎn)品純化的復(fù)雜性，有利于酶的重復(fù)利用［2－4］.因此，固定化酶技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物催化和生物傳感器等領(lǐng)域［5］.酶的固定化載體種類非常豐富，固定化方法也多種多樣，其中紙纖維具有廉價易得等特性而被廣泛應(yīng)用，但將其用于木瓜蛋白酶的固定化報道較少，筆者就選用紙纖維為載體，通過戊二醛交聯(lián)法固定化木瓜蛋白酶，并首次應(yīng)用于抗人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin HCG）抗體的水解制備F（ab′）2片段.

HCG是一種涎糖蛋白.HCG的合成與分泌與妊娠密切相關(guān)，另有許多研究表明：HCG的表達與癌癥也密切相關(guān)［6－7］，由此表明HCG的檢測具有相當(dāng)高的醫(yī)用價值.目前制備早早孕所用抗體均為完整的單克隆抗體，但在制備特異性、靈敏度更高的抗獨特性抗體時，相對分子質(zhì)量較小的IgG片段顯示出諸多優(yōu)于完整抗體的特性.這是因為F（ab′）2的相對分子質(zhì)量是IgG相對分子質(zhì)量的2／3，且抗體Fc的去除使小分子F（ab′）2產(chǎn)生的空間位阻更少，更有利于抗體與抗原的結(jié)合［8］.制備F（ab′）2大多采用胃蛋白酶水解全抗所得，有報道提到胃蛋白酶的溶液pH值較低，容易引起抗體蛋白變性，并且小鼠全抗（IgG1）亞類對胃蛋白酶消化具有抵抗作用［9］，故采用固定化木瓜蛋白酶對抗HCG抗體進行酶切制備F（ab′）2片段.

1 材料與方法

1.1 試 劑

含抗HCG單克隆抗體的小鼠腹水購自杭州博林生物技術(shù)有限公司，木瓜蛋白酶購自Sigma，DEAE陰離子交換介質(zhì)購自美國GE公司，辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG購自珠海百奧生化試劑公司，四甲基聯(lián)苯胺購自上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司，辛酸、硫酸銨、醋酸、醋酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉等試劑均為市售分析純.

1.2 儀 器

主要儀器：AKTA purifer（美國GE Healthcare公司），凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR＋（美國BIO-RAD公司），紫外－可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司，UV-2 000型），酶標(biāo)儀（美國分子儀器有限公司，Spectramax M2型）.

1.3 載體的制備

將2張濾紙（約60g）剪碎，加入自來水，煮沸，煮爛后用紗布過濾，在紙纖維中加入1 000 mL 0.1 mol／L的NaOH溶液，攪拌2～3 h，水洗至pH將近7.0，抽濾，放置冰箱中備用.取適量紙纖維，按1∶9（g／mL）的比例加入0.5 mol／L的 NaOH 溶液，按1 g／mL的比例補加環(huán)氧氯丙烷，60℃水浴攪拌反應(yīng)30 min，抽濾，用去離子水充分洗滌，抽干.

1.4 木瓜蛋白酶液的制備

精確稱取0.01 g木瓜蛋白酶，溶于5 mL pH 5.0，0.01 mol／L醋酸鈉緩沖液中，并含有0.5 mL 1 mmol／L DTT及1 mL 2 mmol／L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，37℃反應(yīng)30 min后對相同緩沖液透析過夜，除去DTT，制得激活的木瓜蛋白酶液.

1.5 酶的固定化方法

紙纖維經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后，再加入質(zhì)量濃度為5 g／mL的對苯二胺水溶液，于45℃下反應(yīng)30 min，用蒸餾水充分洗滌，真空干燥至恒重.以氨化的紙纖維為載體，利用戊二醛載體交聯(lián)法，制備固定化木瓜蛋白酶.具體方法如下：在錐形瓶中加入0.5 g 載 體，0.01 mol／L 的 醋 酸 緩 沖 液 （內(nèi) 含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA），以及一定量的木瓜蛋白酶和25%戊二醛溶液，室溫下攪拌12 h，抽濾，所制得的固定化酶用0.01 mol／L的醋酸緩沖液充分洗滌，室溫下真空干燥至恒重.

1.6 酶活的測定

固定化酶活的測定方法：在試管中加入1 mL的0.01 mol／L 的 醋 酸 緩 沖 液 （pH 5.0，內(nèi) 含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA），8 mL 2%酪蛋白溶液（pH 7.0），37℃水浴預(yù)熱5 min，然后加入一定量的固定化酶，于37℃反應(yīng)30 min后加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，震蕩后于37℃放置10 min，過濾，測濾液在280 nm處的吸光度對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酪氨酸產(chǎn)生的量.酶活定義為每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸所需固定化酶的量.酶活計算公式：

式中：A為吸光度；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，k＝0.007 4；n為稀釋倍數(shù)，n＝15；V為終體積，V＝15 mL；h為酶解時間，h＝30 min.

1.7 抗HCG抗體的粗純

利用辛酸－硫酸銨法對小鼠腹水進行純化.用4倍體積的醋酸緩沖液（60 mmol／L，pH 4.0）稀釋腹水，用0.1 mmol／L NaOH 調(diào)pH 至4.5.將辛酸（25 μL／mL）逐滴加入樣品中，邊滴加邊攪拌，滴完后繼續(xù)攪拌30 min，8 000 r／min離心30 min，取上清液按體積比10∶1與10倍PBS混合，用0.1 mol／L的 NaOH 調(diào)pH 至7.4，然后加入硫酸銨（0.227 g／mL）攪拌30 min后，6 000 r／min離心15 min，棄上清液，將沉淀懸浮于PBS（起始腹水體積的1／5）中.懸浮液用100倍體積的PBS透析過夜.提純樣品于－20℃保存.為防止提純過程中抗體被破壞，以上所有攪拌和操作過程均在4℃條件下進行.

1.8 F（ab′）2 片段的制備

1.8.1 抗體的水解

在試管中加入0.01 mol／L的醋酸緩沖液（內(nèi)含1 mmol／L DTT，2 mmol／L EDTA），40℃水浴預(yù)熱5 min，然后加入1 g的的固定化木瓜蛋白酶（濕重），40℃反應(yīng)30 min.抽濾，除去DTT，得到激活的固定化木瓜蛋白酶.之后，將激活后的固定化木瓜蛋白酶與10 mL抗體溶液（質(zhì)量濃度為1.16 mg／mL）混合，40℃反應(yīng)12 h后反應(yīng)終止，抽濾，除去固定化木瓜蛋白酶，取濾液即為水解好的抗體片段溶液.用非還原性的SDS-PAGE檢測抗體消化程度.

1.8.2 抗 HCG抗體F（ab′）2片段的純化

DEAE-Sepharose-FF陰離子交換法，將消化過的anti-HCG對pH 6.5，20 mmol／L的Tris-HCl（A液）透析過夜，然后上用相同緩沖液平衡過的DEAE-Sepharose-FF陰離子交換柱純化，用0～100%的B液（A液＋1 mol／L的NaCl）線性離子梯度洗脫，2 mL／min流速收集第一個洗脫峰即為F（ab′）2純品.

1.8.3 抗 HCG抗體F（ab′）2片段的純度測定

純化的F（ab′）2片段在非還原條件下進行SDS-PAGE電泳（凝膠質(zhì)量分數(shù)為10%），電泳結(jié)果經(jīng)考馬斯亮藍R-250染色后，用凝膠成像系統(tǒng)檢測，據(jù)F（ab′）2片段占所有區(qū)帶總面積的百分比計算F（ab′）2片段的純度.

1.8.4 抗 HCG抗體F（ab′）2片段活性的測定

參考紀煒［10］等建立的方法：以 MCYST-LR與BSA的偶聯(lián)物（MC-BSA）作為包被抗原，2μg／mL 100μL包被酶標(biāo)板，4℃過夜，棄去包被抗原，PBST洗滌3次后用1%OVA 200μL封閉，37℃孵育1 h.PBST洗滌3次后每孔分別加入100μL，倍比稀釋的抗HCG單克隆抗體、F（ab′）2片段及兔陰性血清pH 7.5的10 mmol／L PB稀釋液，37℃孵育2 h.PBST洗滌3次后每孔加入100μL羊抗兔酶標(biāo)二抗工作液37℃孵育1 h，棄去酶標(biāo)二抗PBST洗滌3次，每孔加入10μL 10 mg／mL四甲基聯(lián)苯胺的二甲亞砜溶解液與65%25μL H2O2的混合液，37℃避光反應(yīng)15 min后每孔加入50μL 2 mol／L H2SO4終止反應(yīng).在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處吸光值，以A陽／A陰＞2.1的最大稀釋倍數(shù)作為其最終效價.其中，PBS為陰性對照，消化前的IgG作陽性對照.

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶固定化條件的確定

2.1.1 pH對固定化木瓜蛋白酶的影響

在不同pH 的醋酸緩沖液（0.01 mol／L，內(nèi)含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA）加入55 mg木瓜蛋白酶和25%的戊二醛溶液（戊二醛的終體積分數(shù)為0.01%），在40℃條件下，與1.2 g預(yù)處理過的紙纖維反應(yīng)12 h，結(jié)果見圖1.

圖1 pH對固定化木瓜蛋白酶的影響Fig.1 Effect of pH on immobilized enzyme activity

結(jié)果表明：在pH 5.0條件下，固定化酶的相對酶活是最高的.pH增高或降低，活力和蛋白載量均有所下降.可能是因為中性偏酸的條件下，H＋離子濃度過低或過高均會影響紙纖維的一些結(jié)構(gòu)特征.所以選pH 5.0作為固定化酶最適pH條件.

2.1.2 給酶量對固定化酶的影響

0.01 mol／L pH 5.0 的 醋 酸 緩 沖 液 （內(nèi) 含1 mmol／L DTT 和2 mmol／L EDTA）加入不同量的木瓜蛋白酶，在溫度為40℃、戊二醛體積分數(shù)為0.01%的條件下，與1.2 g預(yù)處理過的紙纖維反應(yīng)12 h，結(jié)果見圖2.

圖2 給酶量對固定化酶的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on immobilized enzyme activity

結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)固定化酶活力隨著固定化反應(yīng)給酶量的增加而提高的.隨著載體載酶量的增大，酶分子相互間擁擠造成的空間位阻增大.制備纖維素固定化木瓜蛋白酶時，最佳給酶量位46 mg／g.進一步加大給酶量，固定化酶活未有明顯增加.

2.1.3 溫度對固定化酶的影響

取55 mg木瓜蛋白酶溶于0.01 mol／L醋酸緩沖液（pH 5.0，內(nèi)含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA）和0.01%的戊二醛溶液中，在不同的溫度條件下，與1.2 g預(yù)處理過的紙纖維反應(yīng)12 h，結(jié)果見圖3.

圖3 溫度對固定化木瓜蛋白酶的影響Fig.3 Effect of couple temperature on immobilized enzyme activity

結(jié)果表明：隨著溫度的升高，固定化木瓜蛋白酶的活力是逐漸增大的，但是，溫度高于40℃時，固定化木瓜蛋白酶活力開始下降.在高溫下固定化酶活性部分喪失的可能原因是加速了酶分子的伸展作用和構(gòu)象變化，從而使固定化酶的相對酶活降低.因此，固定化木瓜蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為40℃.

2.1.4 戊二醛體積分數(shù)對固定化酶的影響

戊二醛既是固定化反應(yīng)的交聯(lián)劑，同時又是酶的變性劑，不同戊二醛濃度對載體與木瓜蛋白酶的交聯(lián)反應(yīng)影響較大.取55 mg木瓜蛋白酶溶于0.01 mol／L醋酸緩沖液（pH 5.0，內(nèi)含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA）和一定體積分數(shù)的戊二醛溶液中，在溫度為40℃條件下，與1.2 g預(yù)處理過的紙纖維反應(yīng)12 h，結(jié)果見圖4.

圖4 戊二醛體積分數(shù)對固定化木瓜蛋白酶的影響Fig.4 Effect of glutaraldehyde volume fraction on immobilized enzyme activity

戊二醛既是固定化反應(yīng)的交聯(lián)劑，同時又是酶的變性劑.結(jié)果表明：隨著戊二醛濃度的增大，固定化木瓜蛋白酶的相對酶活持續(xù)下降，這是因為當(dāng)戊二醛濃度為0.01%時，酶與載體之間交聯(lián)比較充分，被固定的酶數(shù)量多，酶活高；當(dāng)戊二醛體積分數(shù)增大時，過量的戊二醛會與酶的活性中心結(jié)合，從而導(dǎo)致過度交聯(lián)，對酶的破壞性大，使得酶活下降.經(jīng)計算固定化木瓜蛋白酶酶活達到最高值為19 250 U／g，相對于優(yōu)化前1 940 U／g的酶活有了顯著提升.

2.2 固定化酶的性質(zhì)

2.2.1 固定化酶的最適反應(yīng)pH

如圖5所示，在不同pH值的0.01 mol／L的醋酸緩沖液（內(nèi)含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA）中，測定了固定化酶和溶液酶對底物酪蛋白的水解活力.固定化木瓜蛋白酶的最適pH為7.0，溶液酶的最適反應(yīng)pH為9.0，固定化酶較游離酶向酸性范圍內(nèi)移動了2個單位.木瓜蛋白酶作為一種堿性酶，經(jīng)固定化反應(yīng)后，具有了更好的耐酸性的特征.這可能由于酶經(jīng)固定化后，其活性部位的某些基團的解離狀態(tài)發(fā)生了改變.

圖5 pH對相對酶活的影響Fig.5 Effect of pH on the relative activity of papain

2.2.2 固定化酶的最適反應(yīng)溫度

如圖6所示，在不同溫度下的0.01 mol／L的醋酸緩沖液（內(nèi)含1 mmol／L DTT和2 mmol／L EDTA）中，測定了固定化酶和溶液酶對底物酪蛋白的水解活力.固定化木瓜蛋白酶的最適溫度為50℃，溶液酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，這說明固定化酶較游離酶在較低的溫度下就可以發(fā)揮較高的酶活，更有利于在相對溫和的條件下進行水解反應(yīng)，更好的防止底物變性.

2.3 抗體片段及純度測定結(jié)果

由圖7可見F（ab′）2片段的相對分子質(zhì)量為105 000.圖7中第1與第2泳道比較可以看出：固定化的木瓜蛋白酶水解抗HCG抗體反應(yīng)較溫和，得到的雜質(zhì)較少，有利于進一步純化.圖7中第1與第3泳道比較可以看出：經(jīng)過DEAE柱層析所得F（ab′）2片段已達到電泳純，即已經(jīng)將F（ab′）2片段從全抗和Fc片段中分離出來.

2.4 抗 HCG抗體F（ab′）2 片段活性的測定

由圖8可以看出：固定化木瓜蛋白酶制備的F（ab′）2片段具有免疫活性，為1∶12 000，與原抗體相比免疫活性有所降低（原抗HCG單克隆抗體效價為1∶24 000）.

圖8 ELISA檢測F（ab′）2 片段效價Fig.8 Titers of antibody titers for F（ab′）2 fragments determined by ELISA

3 結(jié) 論

以廉價的紙纖維為載體經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后，成功的固定了木瓜蛋白酶，獲得了酶固定化的適宜條件.在該方法中，酶與載體結(jié)合牢固，不易失活，便于應(yīng)用過程中的質(zhì)量控制.優(yōu)化后酶活從1 940 U／g提升到了19 250 U／g，提升效果顯著.制得的固定化酶與游離酶相比，更有利于在較溫和的條件下進行反應(yīng)，從而更好的保證了底物的活性不被破壞.而且，該固定化酶有效的解決了游離酶不易回收的難題，為木瓜蛋白酶進一步工業(yè)應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ).首次將紙纖維固定化的木瓜蛋白酶應(yīng)用于抗HCG抗體水解制備F（ab′）2片段，并取得了成功.所制得的F（ab′）2片段達到了電泳純，并仍具有較高的活性：效價為1∶12 000.

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Study on the paper cellulose immobilized papain and its exploration

YI Yu1，LI Hui-juan1，CHEN Jian-shu1，MEI Jian-feng1，ZHU Ke-yan2，YING Guo-qing1
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.Boleyn Biological Technology Limited Company of Hangzhou，Hangzhou 300018，China）

To use paper cellulose as a carrier，immobilization of papain on paper cellulose was studied.Thus，papain was immobilized onto glutaraldehyde-activated paper cellulose under acid conditions.The enzymatic properties，such as proteolytic activity，heat-stability，glutaraldehyde volume fraction，enzyme amount and pH-activity profile，of the immobilized papain preparation were examined.The immobilization conditions were optimized by orthogonal experiments.The prepared products were applied to digest anti-HCG to obtain F（ab′）2fragments.The results indicated that the immobilized enzyme has an high activity at 40℃when the pH of the buffer solution is 5.0 as well as with the glutaraldehyde volume fraction is 0.01%.Besides the enzyme concentration is 46 mg／g.The activity of the products can reach up to 19 250 U／g which are ten times higher than those came from the processes not optimized.The preparation and characterization of the F（ab′）2fragments of anti-HCG are presented in detail.The monoclonal antibody was digested with immobilized papain to produce antibody fragment.The F（ab′）2fragments were then purified by using DEAE-FF size exclusion chromatography.The F（ab′）2fragment（110 KDa）maintained potent suppressive activity and the titer can reaches 1∶12 000.

anti-HCG；immobilized protease；papain；F（ab′）2fragment；ELISA；paper cellulose

R981＋.3

A

1006-4303（2013）02-0147-05

2012-03-20

浙江省科技廳資助項目（2011C23070）

易 喻（1978—），男，湖南岳陽人，講師，碩士，主要從事生化制藥相關(guān)研究，E-mail：yiyu1106＠zjut.edu.cn.通信作者：應(yīng)國清教授，E-mail：gqying＠zjut.edu.cn.

（

陳石平）