馮建海， 張 瑋， 李興紅， 燕繼曄＊， 黃金光，3＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，青島 266109；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097；3.山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266109）

甘藍(lán)枯萎病菌REMI轉(zhuǎn)化體系的建立

馮建海1， 張 瑋2， 李興紅2， 燕繼曄2＊， 黃金光1，3＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，青島 266109；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097；3.山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266109）

建立高效、穩(wěn)定的甘藍(lán)枯萎病菌REMI轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步獲得特定表型突變體及基因功能研究建立技術(shù)儲(chǔ)備。利用REMI（restriction enzyme mediate intergration）轉(zhuǎn)化方法，將線性化的含有潮霉素抗性基因的pUCATPH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化甘藍(lán)枯萎病菌A6菌株的原生質(zhì)體，摸索獲得轉(zhuǎn)化子最適的潮霉素篩選濃度以及不同限制性內(nèi)切酶和酶量對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響；利用PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)對(duì)潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子的最適潮霉素篩選濃度為50μg／mL；轉(zhuǎn)化效率較高的限制性內(nèi)切酶為HindⅢ，并且轉(zhuǎn)化效率最高時(shí)的酶量為20U。利用該轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建了含1 050個(gè)轉(zhuǎn)化子的甘藍(lán)枯萎病菌轉(zhuǎn)化子庫，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern驗(yàn)證，證明該轉(zhuǎn)化體系是可行的。

甘藍(lán)枯萎病菌； REMI； 轉(zhuǎn)化子庫

由甘藍(lán)枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans）引起的甘藍(lán)枯萎病是一種典型的土傳病害［1］，受害的甘藍(lán)在苗期即可發(fā)病，最初表現(xiàn)為葉脈變黃，隨著病情的發(fā)展，整葉或全株變黃，進(jìn)而植株變小而萎蔫，最后枯死，剖開植株的短縮莖可見維管束明顯變褐。該病在大葉芥上的癥狀與甘藍(lán)相似，也表現(xiàn)為萎蔫、黃化及枯死［2］。1895年，Smith在美國首次發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)枯萎病，該病害在美國東北部蔓延，隨后在加拿大、日本等國家也相繼報(bào)道［3－6］，近年來，該病害在我國北京、河北等地發(fā)生并迅速蔓延［7］。生產(chǎn)上除抗病品種選育外，至今沒有其他的有效防治措施。

基于甘藍(lán)枯萎病危害日趨嚴(yán)重的現(xiàn)狀，從分子水平上研究其致病機(jī)理，已經(jīng)愈來愈受到重視。甘藍(lán)枯萎病菌REMI轉(zhuǎn)化體系的建立正是為下一步致病相關(guān)基因的研究奠定基礎(chǔ)。限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合技術(shù)（REMI）是1991年由Schiestl等在研究釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的過程中創(chuàng)立的［8］。目前，REMI技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于真菌尤其是植物病原真菌的研究［9－11］，并因其高效性已成為病原真菌研究中的一種重要手段。本研究在掌握甘藍(lán)枯萎病菌原生質(zhì)體的制備和再生基礎(chǔ)上［12］，建立高效的甘藍(lán)枯萎病菌REMI轉(zhuǎn)化體系和構(gòu)建甘藍(lán)枯萎病菌突變體庫，從而為致病相關(guān)基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

甘藍(lán) 枯 萎 病 菌 （Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans）A6菌株，分離自北京市延慶縣甘藍(lán)產(chǎn)區(qū)，保存在北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所植物病害綜合防治研究室；用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pUCATPH由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授惠贈(zèng)，美國康奈爾大學(xué)構(gòu)建。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

1.2.1 主要培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：200g馬鈴薯，20g葡萄糖，15g瓊脂，蒸餾水定容至1L。

CM液體培養(yǎng)基：6g酵母提取物，3g酸水解干酪素，3g酶水解干酪素，10g蔗糖，蒸餾水定容至1L。

液體再生培養(yǎng)基（LR）：1g酵母提取物，1g酶水解干酪素，342g蔗糖，蒸餾水定容至1L。

固體再生培養(yǎng)基（SR）：向1LLR培養(yǎng)基中加入15g瓊脂。

以上培養(yǎng)基均需1×105Pa滅菌20min。

1.2.2 主要試劑

STC：1.2mol／L 山梨醇，10mmol／L Tris－HCl（pH 7.5），50mmol／L CaCl2。

PTC：60% 聚乙二醇（PEG 3350），10mmol／L Tris－HCl（pH 7.5），50mmol／L CaCl2。

0.7mol／L NaCl：40.9g NaCl，ddH2O 定容至1L。

崩潰酶（driselase）：20mg／mL，用預(yù)冷0.7mol／L NaCl配制，2 000g離心10min，上清液經(jīng)20μm微孔濾膜過濾后分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

崩潰酶、酶水解干酪素（casein enzymatic hydrolysate）、酸水解干酪素（casein acids hydrolysate）為美國Sigma公司產(chǎn)品；山梨醇（sorbitol）、PEG3350為美國Amresco公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRI、DNA Marker、瓊脂粉為寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）產(chǎn)品；其他常規(guī)生化試劑國產(chǎn)分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。

1.3 轉(zhuǎn)化方法

向50mL離心管中分別加入150μL原生質(zhì)體，2μg線性化質(zhì)粒pUCATPH，限制性內(nèi)切酶HindⅢ，用STC補(bǔ)足至每管300μL，冰上放置20min。每管逐滴加入2mL PTC溶液，冰上靜置20min。每管各加入25mL預(yù)冷的STC溶液，顛倒混勻，4℃，2 000g離心15min，棄上清，每管加入3mL LR培養(yǎng)基，28℃靜置培養(yǎng)12～18h后，向培養(yǎng)液中加入15mL 50℃左右的SR再生培養(yǎng)基，混勻后鋪板，凝固后在平板表面覆蓋10mL 50℃左右含有50μg／mL Hygromycin B的1.5%水瓊脂。

1.4 潮霉素敏感性測(cè)定

用滅菌的牙簽分別挑取A6菌絲接種到含有不同濃度潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，濃度梯度設(shè)定為10、20、30、40、50、60、70、80μg／mL，28 ℃培養(yǎng)5d后測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5 不同酶量對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

利用不同酶量的限制性內(nèi)切酶HindⅢ介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 A6菌株，酶量分別為5、10、15、20、25、30、35U，其他條件保持不變，重復(fù)3次。

1.6 不同限制性內(nèi)切酶對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

分別用HindⅢ和EcoRI介導(dǎo)轉(zhuǎn)化A6菌株。所用酶量均是20U，其他條件保持不變，重復(fù)3次。

1.7 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌株，以未轉(zhuǎn)化的野生型菌株A6作對(duì)照。提取野生菌株和轉(zhuǎn)化菌株的基因組DNA，用根據(jù)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因設(shè)計(jì)的引物（HPTF：5′－CGACAGCGTCTCCGACCTGA－3′， HPTR：5′－CGCCCAAGCTGCATCATCG AA－3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，3min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，50s；32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)總體系為25μL，其中模板1μL，2× PCR Mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O 10.5μL。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 Southern blot驗(yàn)證

隨機(jī)挑選9個(gè)轉(zhuǎn)化子，以野生型菌株A6作為對(duì)照。大量法提取轉(zhuǎn)化子和野生型菌株的基因組DNA，用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因作為探針，HindⅢ酶切轉(zhuǎn)化子和野生型菌株DNA，用HindⅢ酶切的λDNA作為Marker進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證。

1.9 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性鑒定

甘藍(lán)枯萎病菌轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)過5代單孢繼代培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到添加潮霉素B的PDA培養(yǎng)基平板上，觀察生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)枯萎病菌對(duì)潮霉素B的敏感性測(cè)定

通過測(cè)量野生型A6菌株在添加不同濃度潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上的菌落直徑，發(fā)現(xiàn)隨著潮霉素B濃度增大菌落生長速度逐漸減慢，在50μg／mL時(shí)菌株生長完全受到抑制（圖1）。

圖1 不同濃度潮霉素B對(duì)A6菌株生長速度的影響Fig.1 Influence of hygromycin B at different concentration on the growth of the strain A6

2.2 不同HindⅢ酶量對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖2可知，隨著酶量的增加，轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的個(gè)數(shù)也逐漸增多。當(dāng)酶量超過20U后轉(zhuǎn)化效率沒有明顯提高。

2.3 不同限制性內(nèi)切酶對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

分別用HindⅢ和EcoRI兩種限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化A6菌株，酶量均為20U／管。結(jié)果表明，HindⅢ介導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體個(gè)數(shù)平均為25個(gè)／管，而EcoRI平均僅為10個(gè)／管。

圖2 不同酶量對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Influence of enzymes with different amount on transformation efficiency

2.4 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

分別以野生型A6菌株和轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。如圖3所示，在隨機(jī)挑選的9個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因組中都能夠擴(kuò)增得到預(yù)期大小約為750bp的目的片段，而A6菌株基因組DNA中未擴(kuò)增到任何條帶，表明這些轉(zhuǎn)化子基因組中確實(shí)含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。初步驗(yàn)證了潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因已轉(zhuǎn)化并整合入野生型菌株的基因組DNA中。

圖3 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.3 Identification of the transformants by PCR

2.5 轉(zhuǎn)化子庫的構(gòu)建及Southern blot驗(yàn)證

利用建立的REMI轉(zhuǎn)化體系，用HindⅢ轉(zhuǎn)化A6，共獲得1 050個(gè)轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)選取9個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化子中都含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因并且大部分為單位點(diǎn)插入（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)化子的Southern blot驗(yàn)證Fig.4 Verification of the transformants by Southern blot

2.6 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性鑒定

甘藍(lán)枯萎病菌轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)過5代單孢繼代培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到添加潮霉素B的PDA培養(yǎng)基平板上，仍然生長良好，表明試驗(yàn)所獲得的轉(zhuǎn)化菌株潮霉素B抗性能夠穩(wěn)定遺傳。

3 結(jié)論與討論

制備原生質(zhì)體是進(jìn)行絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，在Cochliobolusheterostrophus［8］、Aspergillusalternate［10］中，已成功得到轉(zhuǎn)化所用的原生質(zhì)體產(chǎn)量均在106個(gè)／mL，因此獲得一定濃度、純度和活力的原生質(zhì)體是絲狀真菌進(jìn)行分子遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提。本研究在掌握甘藍(lán)枯萎病菌原生質(zhì)體的制備和再生基礎(chǔ)上［12］，利用REMI轉(zhuǎn)化技術(shù)將含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒成功整合到了甘藍(lán)枯萎病菌基因組中。

潮霉素對(duì)不同真菌的影響不同，對(duì)木霉的篩選濃度為250μg／mL［13］，稻瘟病菌的篩選濃度為300μg／mL［14］，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)潮霉素B濃度大于50μg／mL時(shí)，甘藍(lán)枯萎病菌分生孢子的萌發(fā)完全受到抑制且菌絲幾乎不能生長，因此試驗(yàn)采用50μg／mL作為甘藍(lán)枯萎病菌的潮霉素篩選濃度。本研究所用質(zhì)粒含有很多酶切位點(diǎn)，其中限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRI在絲狀真菌REMI轉(zhuǎn)化中使用效率較高，因此本試驗(yàn)對(duì)這兩種酶的轉(zhuǎn)化效率做了比較，發(fā)現(xiàn)用限制性內(nèi)切酶HindⅢ的轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高。通過不同酶量轉(zhuǎn)化效率的比較，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶量超過20U后轉(zhuǎn)化效率沒有明顯提高，因此本研究選用酶量為20U。但有文獻(xiàn)曾報(bào)道隨著酶量的增多，轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)也會(huì)相應(yīng)增多［15］。

REMI轉(zhuǎn)化因在真菌轉(zhuǎn)化上的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)方法的轉(zhuǎn)化效率，已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用到真菌轉(zhuǎn)化中，但同時(shí)也存在一些局限性，如轉(zhuǎn)化機(jī)理還不夠明確，轉(zhuǎn)化過程中多拷貝插入率較高等。目前在真菌中，一些酵母菌的Agrobacteriumtumefaciens介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（ATMT）首先獲得成功，隨后ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)已擴(kuò)展到一些絲狀真菌的轉(zhuǎn)化。相對(duì)于REMI轉(zhuǎn)化，ATMT轉(zhuǎn)化可以省略原生質(zhì)體制備的過程，并且在一些真菌轉(zhuǎn)化上可以單拷貝地隨機(jī)插入到染色體中，該項(xiàng)工作不僅為絲狀真菌的轉(zhuǎn)化提供了新的途徑，而且T－DNA轉(zhuǎn)化在插入突變和標(biāo)記基因方面具有相當(dāng)?shù)臐摿Γ峁┝诵碌目赡芡緩?。本試?yàn)在研究REMI介導(dǎo)整合轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上將進(jìn)一步探討A.tumefaciens介導(dǎo)的方法，建立起了一套完整、有效的尖孢鐮刀菌A.tumefaciens介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

另外試驗(yàn)中還存在一些問題，如獲得單拷貝的轉(zhuǎn)化子效率相對(duì)不高，轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性尚有待提高。因此還需要進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，提高轉(zhuǎn)化效率。

本研究通過構(gòu)建REMI轉(zhuǎn)化子庫，對(duì)獲得的部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證分析，確認(rèn)轉(zhuǎn)化子中含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因并且大部分為單位點(diǎn)插入，并篩選出了一批產(chǎn)孢和致病力發(fā)生明顯變化的轉(zhuǎn)化子，這對(duì)克隆甘藍(lán)枯萎病菌產(chǎn)孢和致病相關(guān)基因具有重要意義。

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Construction of transformation system inFusarium oxysporumf.sp.conglutinansby REMI

Feng Jianhai1， Zhang Wei2， Li Xinghong2， Yan Jiye2， Huang Jinguang1，3
（1.CollegeofCropProtectionandAgronomy，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China；2.InstituteofPlantandEnvironmentProtection，BeijingAcademyofAgricultureand ForestrySciences，Beijing100097，China；3.KeyLabofIntegratedCropPest ManagementofShandongProvince，Qingdao266109，China）

Establishment of an efficient and stable REMI transformation system inFusariumoxysporumf.sp.conglutinansby restriction enzyme－mediated integration is a key step to build a transformants library for further studying mutants with specific phenotype and gene function.By REMI transformation method，the linearized pUCATPH plasmid containing the hygromycin resistance gene was transformed into the protoplasts ofF.oxysporumstrain A6.The hygromycin concentration to transformants was optimized，and different restriction enzymes were tested on the transformation efficiency.Hygromycin－resistant transformants were checked by PCR.Hygromycin at 50μg／mL was optimal for screening transformants.Transformation efficiency byHindⅢ was higher than other enzymes，and reached to the highest at 20 U.A library with1 050 transformants was built by the REMI transformation system.The Southern blot results proved the feasibility of the transformation system.

Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans； REMI； transformants library

S 436.35

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2013.03.020

2012－08－28

2012－09－24

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（2000903049）；北京市農(nóng)林科學(xué)院植保環(huán)保所創(chuàng)新基金（CXJJ200901）；山東省“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金（631217）

＊ 通信作者E－mail：jghuang＠qau.edu.cn