周泉勇，萬明春，楊 群，霍俊宏，唐艷強(qiáng)，黃江南

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200)

隨著人們生活水平不斷提高，居民的生活方式和消費(fèi)觀念逐步發(fā)生變化，消費(fèi)者對(duì)豬肉產(chǎn)品的需求向高檔、特色、風(fēng)味等方向發(fā)展，對(duì)豬肉的品質(zhì)要求也越來越高，生產(chǎn)和消費(fèi)優(yōu)質(zhì)豬肉逐漸成為主流。肌內(nèi)脂肪，即沉積在肌肉內(nèi)的脂肪，其含量與豬肉的嫩度和風(fēng)味直接相關(guān)，是豬肉品質(zhì)的重要性狀之一。研究顯示，豬IMF含量的下降是造成豬肉質(zhì)量下降的主要原因之一[1]，2% ～3%的肌內(nèi)脂肪含量就可產(chǎn)生理想的口感，但長期的高瘦肉率選擇已使現(xiàn)有商品豬的肌內(nèi)脂肪含量下降到1% ～1.5%，導(dǎo)致肉品質(zhì)量逐漸不能滿足當(dāng)前消費(fèi)者的需求。如何在保證瘦肉率的情況下，提高豬肌內(nèi)脂肪的含量，滿足當(dāng)前市場(chǎng)中消費(fèi)者的需求，已成為育種者的新目標(biāo)之一。

心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(heart fatty acid binding protein，H－FABP)是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的影響豬肌內(nèi)脂肪含量的候選基因之一[2]。其定位于6號(hào)染色體SW376－S0003區(qū)間內(nèi)，與6號(hào)染色體上影響肉質(zhì)的QTL緊鄰，編碼一個(gè)大小為15 KDa的包漿蛋白。H－FABP在細(xì)胞內(nèi)與脂肪酸結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)外保持一定的濃度差，促使細(xì)胞攝取脂肪酸。Gerbens等最早發(fā)現(xiàn)并報(bào)道該基因具有3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中HaeIII位點(diǎn)位于5’UTR，HinfI和MspI位點(diǎn)位于第2內(nèi)含子，HaeIII有D和d等位基因，HinfI則有H和h等位基因，MspI酶切位點(diǎn)有A和a等位基因。進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，aaddHH基因型比AADDhh基因型豬的肌內(nèi)脂肪含量高0.4%，且差異顯著[3]。近年來，國內(nèi)對(duì)該基因的研究報(bào)道也逐漸多起來。李長龍，曲亮，彭淑紅等分別對(duì)松遼黑豬，撒壩豬，金華豬等多個(gè)地方品種進(jìn)行了該基因的多態(tài)性研究[4－6]。

與當(dāng)前市場(chǎng)中的杜、長、大等外來品種豬相比，我國地方豬品種肉質(zhì)均較優(yōu)，這與肌內(nèi)脂肪含量有直接關(guān)系，其含量遠(yuǎn)高于外來品種，均達(dá)3%以上[7]。而以優(yōu)良肉質(zhì)聞名中外的玉山黑豬更是其中翹首，其含量甚至高達(dá) 7.41%[8]。

本研究以玉山黑豬為研究對(duì)象，利用PCR－RFLP技術(shù)調(diào)查了H－FABP基因的5’－UTR和內(nèi)含子2中遺傳突變位點(diǎn)在玉山黑豬和外來豬種中的基因型分布情況，并利用Real－time－PCR技術(shù)對(duì)該基因在外來豬種和玉山黑豬骨骼肌組織中的表達(dá)進(jìn)行了比較研究，以期為玉山黑豬的保種及利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料分別采自江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)和江西省玉山黑豬原種場(chǎng)。用于遺傳多樣性分析的樣本為玉山黑豬耳組織32份，長白豬耳組織20份，大白豬耳組織20份，杜洛克豬耳組織19份。耳號(hào)鉗取耳組織后放入裝有75%乙醇的Eppendorf管中保存于－20℃冰箱。用于基因表達(dá)分析的樣本為3頭成年大白豬和3頭成年玉山黑豬的心、肝、脾、肺、腎、脂肪和骨骼肌組織。屠宰取樣后迅速置于液氮中，－80℃冰箱保存。

1.2 組織DNA和RNA的提取

DNA的提取采用酚－氯仿法，總RNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(DP431)，具體操作步驟詳見試劑盒說明書。提取的RNA用Thermo scientific公司的NanoDrop 2000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度。

1.3 表達(dá)檢測(cè)樣本的制備

在DEPC處理過的無 RNase污染的的0.2 mL的離心管中加入2 μg的總 RNA，0.4 μg的 oligo(dT)引物和0.1 μg的隨機(jī)引物，70℃溫育5 min，迅速置于冰上，然后一次加入10 μL 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，2.5 μL 10 mmol/L dNTP mix，1 μL RNase inhibitor和 1.5 μL M － MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)，用無核酸水將終體積補(bǔ)至50 μL，混勻離心后于37℃溫育10 min，42℃溫育50 min，最后85℃溫育5 min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA于－20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Gerbens等發(fā)表的序列，應(yīng)用Primer Premier5.0軟件分別設(shè)計(jì)酶切引物和定量檢測(cè)引物。合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。引物序列、PCR產(chǎn)物的大小、Tm值見表1。

1.5 PCR －RFLP

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 25 μL:基因組 DNA 1 μL(約 50 ng)，引物(10 umol/L)各 1 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL，滅菌水 17.3 μL。PCR 擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，適宜退火溫度40 s，72℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)合格后，用于酶切。酶切體系為10 μL:擴(kuò)增模板3 μL，內(nèi)切酶(10 U/μL)1.5 μL，滅菌水5.5 μL。適宜溫度酶切過夜后經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，用于分型。

表1 H－FABP基因PCR引物序列及片段大小Tab.1 The primer sequences and product size for H －FABP PCR

1.6 Real－time PCR

反應(yīng)體系為 20 μL，其中 cDNA 各 0.8 μL，SYBR green I Mix 10 μL，正反向引物各 0.4 μmol/L，剩余用滅菌純凈水補(bǔ)足。樣品在96孔板混合均勻后直接放入ABI 7 300實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 s，1 個(gè)循環(huán)，95 ℃15 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)，95 ℃15 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s，60℃1 min，1個(gè)循環(huán)。檢測(cè)基因與內(nèi)參基因同時(shí)擴(kuò)增，表達(dá)的相對(duì)量以目標(biāo)基因與內(nèi)參基因Ct值(取3個(gè)重復(fù)的平均值)的差值ΔCt計(jì)算，再選取ΔCt最大作為參照，用其它樣品的ΔCt減去參照ΔCt得到ΔΔCt，Ct值大于35的視為無效數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果

擴(kuò)增H－FABP基因HaeIII多態(tài)位點(diǎn)所在序列的PCR產(chǎn)物長度為583 bp。HaeIII酶切后，酶切的片段為583 bp時(shí)，定義為D，酶切的片段為(212+371)bp時(shí)，定義為d(圖1)。

圖1 H－FABP基因HaeIII多態(tài)位點(diǎn)酶切圖。Fig.1 The digested map of HaeIII polymorphic site of H －FABP

圖2 H－FABP基因HinfI多態(tài)位點(diǎn)酶切圖。Fig.2 The digested map of HinfI polymorphic site of H －FABP

表2 H－FABP基因多態(tài)位點(diǎn)基因型分布和基因頻率Tab.2 Genotype and allele frequencies of the H －FABP gene polymorphism size

擴(kuò)增H－FABP基因HinfI多態(tài)位點(diǎn)所在序列的PCR產(chǎn)物長度為291 bp。HinfI酶切后，酶切的片段為(172+119)bp時(shí)定義為h，酶切的片段為(114+59+119)bp時(shí)定義為H(圖2)。

2.2 不同豬種H－FABP基因的PCR－RFLP基因型及基因頻率

利用PCR－RFLP方法，檢測(cè)了H－FABP基因HaeIII和HinfI位點(diǎn)在玉山黑豬、長白、大白和杜洛克豬中的基因型分布和基因頻率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

2.3 H－FABP基因組織表達(dá)譜

以β－aCtLin為內(nèi)參，利用Real－time PCR方法檢測(cè)H－FABP基因在心、肝、脾、肺、腎、脂肪和骨骼肌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)H－FABP基因主要在心、腎、脂肪和骨骼肌組織中表達(dá)，并在心和骨骼肌組織中的表達(dá)量最高(圖3)。

2.4 玉山黑豬和大白豬中H－FABP基因差異表達(dá)情況

以β－aCtLin為內(nèi)參，檢測(cè)H－FABP基因在玉山黑豬和大白豬心、腎、脂肪和骨骼肌組織中的表達(dá)差異情況，發(fā)現(xiàn)玉山黑豬在心和骨骼肌組織中H－FABP基因的表達(dá)均高于大白豬，差異倍數(shù)分別為3.34和3.42，且差異顯著，在腎和脂肪組織中的表達(dá)與大白豬不存在顯著性的差異(圖4)。

圖3 H－FABP基因在玉山黑豬成年個(gè)體組織表達(dá)圖。Fig.3 the expression of H －FABP gene in different tissues of Yushanhei pigs.

圖4 H－FABP基因在玉山黑豬和大白豬組織中表達(dá)差異圖。Fig.4 The expression levels of H －FABP gene in Yushanhei pigs and Yorkshire different tissues.

3 結(jié)論與討論

H－FABP基因在不同豬種中的多態(tài)性研究表明，HaeIII和HinfI位點(diǎn)在外來品種中存在豐富的多態(tài)性，而在國內(nèi)地方品種中多表現(xiàn)為單態(tài)或以某一等位基因?yàn)橹?。變異在中外豬種中分布極不均衡。HinfI位點(diǎn)的等位基因H為肌內(nèi)脂肪含量的有利等位基因。研究表明，HH型肌內(nèi)脂肪含量比 hh型高0.4%[1]。對(duì)含有較高的肌內(nèi)脂肪并以肉質(zhì)鮮美著稱的國內(nèi)地方豬種如金華豬、撒壩豬等進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其均具有較高頻率的等位基因H，分別為0.66和0.60。在本試驗(yàn)中，H基因在玉山黑豬中的頻率更高，達(dá)到了0.98，這也與玉山黑豬高達(dá)7.41%的肌內(nèi)脂肪含量(金華豬為3.95%)相符合[9]。HaeIII位點(diǎn)在國內(nèi)地方豬種中主要以D等位基因?yàn)橹?，在蘇淮豬和金華豬中，D等位基因分別為0.73和1[6，10]。本試驗(yàn)中，同樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)玉山黑豬均表現(xiàn)為D型單一等位基因，與國內(nèi)其它地方品種檢測(cè)結(jié)果一致，說明在玉山黑豬中HaeIII位點(diǎn)同樣不能提供肌內(nèi)脂肪的有效遺傳標(biāo)記。

利用Real－time PCR方法，本試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H－FABP基因主要在心、腎、脂肪和骨骼肌組織中表達(dá)，且心肌組織中的表達(dá)量高于骨骼肌。這一結(jié)果與雅南豬中的檢測(cè)結(jié)果一致[11]，與黃河等人對(duì)藏豬H－FABP基因在脂肪中的表達(dá)最高不一致[12]，推測(cè)可能與不同地域的豬品種有關(guān)。H－FABP是影響豬肌內(nèi)脂肪含量的候選基因之一[2]，在細(xì)胞內(nèi)與脂肪酸結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)外保持一定的濃度差，促使細(xì)胞攝取脂肪酸。Gerbens等研究顯示，H－FABP基因在mRNA水平上與肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)。與外來品種長白、大白、杜洛克等相比較，玉山黑豬的肌內(nèi)脂肪明顯較高。在本試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果中，玉山黑豬在心和骨骼肌組織中H－FABP基因的表達(dá)量顯著高于大白豬，差異倍數(shù)分別為3.34和3.42。這也進(jìn)一步證明了高表達(dá)的H－FABP基因有利于豬肌內(nèi)脂肪的沉積。

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