潘 娟，曲延剛，劉 毅

(湖北省恩施州中心醫(yī)院1.病理診斷中心;2.婦產(chǎn)科，湖北恩施445000)

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor κB，NF-κB)信號通路屬于轉(zhuǎn)錄因子家族成員。在靜止細胞中，NF-κB 與其抑制性分子 IκB(α/β/ε)形成穩(wěn)定的復(fù)合物存在于細胞質(zhì)。當受到某些因子刺激后，復(fù)合物中的IκBα在IκB激酶IKK的作用下磷酸化，脫下IκBα的NF-κB轉(zhuǎn)移到細胞核，進而激活它們的下游靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用［1］。NF-κB信號通路在炎性反應(yīng)、感染、腫瘤及淋巴細胞生成中都扮演著重要角色［2］。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)是廣為人知的 NF-κB依賴性血管生成相關(guān)因子，它們在腫瘤細胞內(nèi)表達的高低反映腫瘤細胞潛在的血管生成能力［3－6］。PDTC(pyrrolydine dithiocarbamate)作為 NF-κB 活性抑制劑，它能夠通過抑制 NF-κB的活性，促進ARPE-19細胞中炎性調(diào)節(jié)因子的表達［7］;打擊人胰腺癌的血管生成潛能［4］。在人大腸癌中，抑制NF-κB的活性是否也可以降低血管生成因子VEGF和b-FGF的表達，進而影響大腸癌的體外血管生成能力?目前尚無文獻報道。本研究擬觀察NF-κB抑制劑PDTC對人大腸癌Lovo細胞系體外促HUVEC血管生成能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人大腸癌Lovo細胞系和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(重慶醫(yī)科大學(xué)湯唯學(xué)教授惠贈)，PDTC(碧云天公司)，鼠抗人NF-κB抗體、兔抗人b-FGF抗體和兔抗人 β-actin抗體(Santa Cruz公司)，鼠抗人p-IκBα 抗體(Cell Signaling公司)，兔抗人VEGF抗體(博士德生物工程有限公司)，辣根酶標記山羊抗兔、抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，24 Well Transwell Permeable Supports(Millipore公司)，Matrigel(BD 公司)，CCK-8試劑盒(Dojindo公司)。

1.2 NF-κB抑制劑PDTC處理Lovo細胞

實驗組PDTC按照終濃度5 mmol/L加入到Lovo細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1 h。未作處理Lovo細胞為對照組［8］。

1.3 Western blot

分別收集處于對數(shù)生長期的各組Lovo細胞養(yǎng)至1.0×106個/mL。蛋白提取液分別提取各組細胞蛋白，操作按試劑盒說明書進行。Bradford法(考馬斯亮藍法)測定各組蛋白濃度，8%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并封閉非特異性結(jié)合位點之后，分別用抗NF-κB、p-IκBα、VEGF、b-FGF 和 β-actin 的一抗孵育(抗體稀釋濃度分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000和1∶500)，4 ℃ 冰箱過夜，辣根酶標記的二抗孵育2 h，ECL試劑檢測膜上的免疫反應(yīng)條帶，凝膠成像儀下觀察并進行分析。以對照組Lovo細胞各種待檢蛋白分別與β-actin吸光度的相對比值計算，每項檢測重復(fù)6次(n=6)。

1.4 HUVEC體外遷移能力檢測

采用Transwell小室體外細胞遷移實驗，參照Sanda等［9］的方法稍加修改。將處于對數(shù)生長期的各組Lovo細胞分別種植到24孔板，1.0×105個/孔，含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基加入下室補齊2.0×10－4L/孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培育1 d，次日將處于對數(shù)生長期的HUVEC種植到小室，1.0×105個/Transwell小室，加 DMEM 培養(yǎng)液入小室內(nèi)補齊1×10－4L/孔，再將小室分別置于24孔板上同兩組Lovo細胞共培養(yǎng)，8 h后PBS液清洗，棉簽擦去內(nèi)室細胞，95%乙醇固定15 min，HE染色，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察HUVEC遷移情況并計數(shù)(高倍鏡400倍下隨機選取5個視野)。

細胞遷移抑制率=(對照組平均遷移細胞數(shù)－實驗組平均遷移細胞數(shù))/對照組平均遷移細胞數(shù)×100%。

1.5 HUVEC增殖活性檢測

采用 CCK-8細胞增殖檢測實驗，參照 Yang等［10］的方法稍加修改。取各組Lovo細胞2×106個分別加入到0.1 L培養(yǎng)瓶，加含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基至每瓶總體積2×10－3L，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)各組Lovo細胞，48 h后收集各組上清液。將處于對數(shù)生長期的HUVEC種植入96孔板，2×103個/孔，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液補齊1×10－4L/孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培育1 d，次日吸凈培養(yǎng)液，分別向孔內(nèi)加入不同組別Lovo上清液2×10－5L，再向孔內(nèi)加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液各8×10－5L使每孔總體積仍為1×10－4L，設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培育72 h后加 CCK-8試劑1×10－5L/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育4 h后測450 nm處A值。

細胞增殖抑制率=(對照組平均A值－實驗組平均A值)/對照組平均A值×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組 Lovo 細胞 NF-κB、p-IκBα、VEGF 和b-FGF的蛋白表達

實驗組細胞內(nèi) NF-κB、p-IκBα、VEGF 和b-FGF蛋白表達量顯著低于對照組 (P＜0.05)(圖1，表1)。

2.2 PDTC對HUVEC體外遷移能力的影響

實驗組HUVEC的遷移數(shù)量為65±3，顯著低于對照組128±4(P＜0.05)(圖2)。PDTC對HUVEC的遷移抑制率為49.2%。

2.3 PDTC對HUVEC體外增殖能力的影響

實驗組HUVEC的增殖數(shù)量為0.514±0.056(以450 nm處測得的A值表示)，顯著低于對照組的1.915±0.121(P＜0.05)。PDTC對HUVEC的增殖抑制率為73.2%。

圖1 各組Lovo細胞NF-κB、p-IκBα、VEGF和b-FGF蛋白表達情況Fig 1 Expressions of NF-κB，p-IκBα，VEGF and b-FGF protein in each groups Lovo cells

表1 各組 Lovo細胞 NF-κB、p-IκBα、VEGF和 b-FGF表達量Table 1 Expressions of NF-κB，p-IκBα，VEGF and b-FGF in each groups Lovo cells(x±s，n=6)

圖2 各組HUVEC的遷移能力Fig 2 The migration of HUVEC in each groups(×400)

3 討論

NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，這個家族共有5個成員，它們通過不同組合形成二聚體，存在于細胞質(zhì)。當受到某些因子刺激后，NF-κB轉(zhuǎn)移到細胞核，發(fā)揮生物學(xué)作用，NF-κB活化一個不可或缺的環(huán)節(jié)就是IκBα 的磷酸化和 NF-κB 入核［1］。本研究通過測定胞質(zhì) p-IκBα和胞核 NF-κB的表達，其結(jié)果顯示PDTC處理細胞后胞質(zhì)p-IκBα和胞核NF-κB的表達都明顯降低，說明PDTC在作用Lovo細胞1 h后成功抑制了NF-κB活性。

VEGF和b-FGF為NF-κB依賴性促血管生成因子，它們受 NF-κB 的調(diào)節(jié)［3-6］。本研究結(jié)果顯示，實驗組VEGF和b-FGF的表達較對照組明顯降低，說明在人大腸癌Lovo細胞中NF-κB活性受到抑制后，其血管生成相關(guān)因子VEGF和b-FGF表達是降低的，它們受到NF-κB的正向調(diào)節(jié)。同時有文獻報道，在培養(yǎng)的骨肉瘤細胞、人神經(jīng)母細胞瘤細胞的上清液中有 VEGF 存在［11－12］，VEGF 以分泌形式發(fā)揮其侵襲和促血管生成作用。在培養(yǎng)的肥胖癥患者脂母細胞的上清液中也有VEGF存在，其可能在肥胖相關(guān)的2型糖尿病中起著促炎作用［13］。b-FGF也可以分泌形式促進角膜損傷細胞修復(fù)［14］，導(dǎo)致豬心肌缺血再灌注損傷模型的骨髓間充質(zhì)干細胞向血管分化［15］?；?VEGF和 b-FGF都屬于可分泌蛋白［11－15］，本研究收集各組 Lovo細胞的上清液分別培養(yǎng) HUVEC，并采用 CCK-8細胞增殖實驗檢測HUVEC增殖能力，結(jié)果顯示，實驗組HUVEC的增殖能力明顯降低。同時本研究采用Transwell細胞遷移實驗檢測HUVEC的遷移能力，結(jié)果顯示，實驗組HUVEC的遷移能力亦明顯減弱。因此認為，Lovo細胞內(nèi)NF-κB活性的抑制可以降低HUVEC體外促血管生成能力，其可能是通過降低細胞內(nèi)促血管生成因子VEGF、b-FGF等的表達，進而減少它們的分泌來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在人大腸癌Lovo細胞中，NF-κB抑制劑PDTC作用1h后能顯著抑制NF-κB的活性;PDTC能降低促血管生成因子VEGF、b-FGF等的表達;PDTC能抑制HUVEC體外促血管生成能力，這可能與VEGF、b-FGF等的分泌減少有關(guān)，其詳盡機制尚需進一步探討。

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