米亞英，楊麗麗，孫利平

(1.大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，山西大同037009;2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，山西太原030013;3.山西省大同市第五人民醫(yī)院免疫風(fēng)濕科，山西大同037006)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA)是最常見(jiàn)的系統(tǒng)性自身免疫病之一，其病理改變?yōu)閷?duì)稱性、進(jìn)行性及侵蝕性的多關(guān)節(jié)慢性炎性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，病變?nèi)羟治g關(guān)節(jié)滑膜下層的軟骨和骨組織，最終可造成關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、功能障礙。隨著高遷移率族蛋白1(high mobility group box chromosomal protein l，HMGB1)及相關(guān)配體 TLR2、TLR4的發(fā)現(xiàn)［1－3］，越來(lái)越多的證據(jù)表明，HMGB1/TLR與 RA 有著密切關(guān)系［4－5］。本實(shí)驗(yàn)用ELISA檢測(cè)不同分期RA患者血清中HMGB1的表達(dá)，用FCM檢測(cè)外周血單核細(xì)胞表面TLR2和TLR4的表達(dá)，旨在探求HMGB1/TLR通路在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用，為進(jìn)一步尋找治療RA的新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料:所有標(biāo)本的選取均獲得知情同意，受試病例均為2009年10月至2010年4月大同市第五人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診及住院患者。排除在納入前1個(gè)月內(nèi)服用過(guò)激素、免疫抑制劑或其他影響免疫功能的藥物及感染，腫瘤等疾病。

據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)在ACR1987年RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為活動(dòng)期和非活動(dòng)期:其中活動(dòng)期29例，男9例，女20例，年齡(53.6 7.0)歲;非活動(dòng)期20例，男5例，女15例，年齡(51.7 15.6)歲。對(duì)照組18例，男6例，女12例，均為性別、年齡與RA患者相匹配的健康體檢者(均獲得患者知情同意)。

1.1.2 主要試劑:HMGB1 ELISA試劑盒(R＆D公司)，TLR4-PE(eBioscience 公 司)，CD14-FITC、TLR2-APC、小鼠IgG1 APC同型對(duì)照、小鼠 IgG1 PE同型對(duì)照(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測(cè)血清中HMGB1的含量:所有受試者于清晨空腹抽取新鮮靜脈血2 mL，離心分離血清，－20℃保存。常規(guī)雙抗體夾心法檢測(cè)，450 nm處檢測(cè)A值，CurveExpert分析，求得血清中HMGB1的實(shí)際濃度。

1.2.2 FCM檢測(cè)單核細(xì)胞表面TLR2、TLR4的表達(dá):每管取新鮮EDTA抗凝全血100μL;一管加入20μL CD14-FITC、10μL Mouse-IgG1-APC、20μL Mouse-IgG1-PE作為同型對(duì)照，一管加入20μL CD14-FITC、20 μL TLR2-APC、5 μL TLR4-PE;混勻后4℃下避光保存20 min;加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，充分振蕩混勻室溫靜置10 min，1 500 r/min，離心7 min，棄上清;加 PBS 2 mL洗滌，同速離心，棄上清;再加PBS 2 mL洗滌，同速離心，棄上清;加PBS 200μL待測(cè)，每次上機(jī)測(cè)試前需振蕩混勻，BD FACSAria流式細(xì)胞儀檢測(cè);在BD FACSDiva軟件下，用FCSExpress Version 3進(jìn)行分析。CD14+單核細(xì)胞表面TLR2、TLR4表達(dá)率以檢測(cè)樣品陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率減去樣品同型對(duì)照陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率表示，TLR2、TLR4蛋白相對(duì)含量以平均熒光指數(shù)(mean fluorescence index，MFI)表示，MFI=(樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度－同型對(duì)照樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度)/正常對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HMGB1蛋白在RA患者與健康對(duì)照者血清中的表達(dá)水平

活動(dòng)期RA患者血清HMGB1蛋白水平為63.48±3.39μg/L，明顯高于非活動(dòng)期的18.70±1.83μg/L和對(duì)照者的 16.01±0.57μg/L(p＜0.05);非活動(dòng)期RA患者與對(duì)照者無(wú)差異。

2.2 TLR2在CD14+單核細(xì)胞上的表達(dá)水平

活動(dòng)期RA患者CD14+單核細(xì)胞上TLR2的表達(dá)率及蛋白相對(duì)含量，均顯著高于非活動(dòng)期及對(duì)照者(P ＜0.05)(圖1，表1)。

2.3 TLR4在CD14+單核細(xì)胞上的表達(dá)水平

活動(dòng)期RA患者CD14+單核細(xì)胞上TLR4的表達(dá)率及蛋白相對(duì)含量，均顯著高于非活動(dòng)期及對(duì)照者(p＜0.05);非活動(dòng)期RA患者CD14+單核細(xì)胞上TLR4的表達(dá)率及蛋白相對(duì)含量亦顯著高于對(duì)照者(P ＜0.05)(圖2，表1)。

2.4 相關(guān)分析

活動(dòng)期RA患者血清HMGB1蛋白含量與TLR2、TLR4蛋白相對(duì)含量呈正相關(guān)(p＜0.05)。

表1 TLR2和TLR4在RA患者和健康對(duì)照者CD14+單核細(xì)胞上的表達(dá)Table 1 The expression of TLR2 and TLR4 on CD14+monocytes of RA patients and healthy controls(x±s)

3 討論

RA是常見(jiàn)的以關(guān)節(jié)組織慢性炎性反應(yīng)為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫病。其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了。近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者都在探索直接針對(duì)RA發(fā)病過(guò)程的生物制劑，以期對(duì)RA進(jìn)行徹底治療。先前人們公認(rèn)導(dǎo)致RA的主要細(xì)胞因子為TNF-α和IL-1與TNF-α和IL-1相比，HMGB1出現(xiàn)時(shí)間較晚，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，被稱為晚期炎性細(xì)胞因子［6］。本研究通過(guò)對(duì)RA患者血清HMGB1的檢測(cè)，試圖探討RA患者HMGB1的變化。結(jié)果顯示，活動(dòng)期RA患者血清HMGB1明顯高于非活動(dòng)期RA和對(duì)照者，認(rèn)為血清HMGB1可作為評(píng)價(jià)RA病情活動(dòng)的指標(biāo)。

新近研究證實(shí)，Toll樣受體(TLR2和TLR4)參與 HMGB1 的識(shí)別［7－8］，熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)和免疫沉淀反應(yīng)顯示HMGB1和TLR2、TLR4分子表面的相互作用。本研究檢測(cè)RA患者及對(duì)照者外周血CD14+單核細(xì)胞表面TLR2和TLR4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期RA患者TLR2、TLR4表達(dá)率及蛋白相對(duì)含量均顯著高于非活動(dòng)期RA患者和對(duì)照者，提示TLR2、TLR4的表達(dá)與RA病情的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有關(guān)系。推測(cè)TLR2、TLR4可增強(qiáng)外周血單核細(xì)胞的活化和下游信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)，并通過(guò)激活TLRs信號(hào)通路參與RA病情進(jìn)展。相關(guān)分析表明:在活動(dòng)期 RA患者HMGB1與 TLR2、TLR4的表達(dá)呈正相關(guān)，說(shuō)明HMGB1與TLR2、TLR4在活動(dòng)期RA患者中表達(dá)同步，推測(cè)當(dāng)某些因子刺激PBMC合成HMGB1，會(huì)導(dǎo)致其大量釋放入血，HMGB1可能通過(guò)單核細(xì)胞胞膜上的TLR2、TLR4進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，激活下游炎性介質(zhì)釋放的瀑布效應(yīng)。

總之，我們推測(cè)HMGB1/TLR通路可能是RA發(fā)病中炎性反應(yīng)信號(hào)的重要啟動(dòng)因素，探討其在RA發(fā)生和發(fā)展中的確切機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而研制出一種阻斷或抑制這條途徑激活的藥物，對(duì)阻斷RA炎性反應(yīng)的進(jìn)一步放大，有效預(yù)防和治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有一定意義。當(dāng)然，本研究樣本量小，只是將HMGBI/TLR與RA之間關(guān)系做了初步探討，至于HMGBI/TLR在RA中的確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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