楊海燕，佘 強，張玉方

(1.重慶市第三人民醫(yī)院老年心血管科，重慶400014;2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶400016;3.重慶市江北區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，重慶400020)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心肌細胞膜離子通道的異?；顒?，形成電重構(gòu)，可能是導致AMI后出現(xiàn)心律失常的原因。抗心律失常藥物的應(yīng)用減少了心律失常的發(fā)生，但同時又有致心律失常的潛在風險，這就需要新的更安全的抗心律失常藥物。他汀類藥物目前研究較多，它具有抗心律失常作用［1］，尚未見報道其有致心律失常的作用，但其抗心律失常的機制尚不明確。瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)在心肌動作電位的快速復極I期中起重要作用，目前認為大鼠Ito主要由Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3編碼;研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠AMI后，心室肌細胞Ito電流密度下降［2］，但尚無各時間點對比的報道。本研究觀察大鼠AMI模型不同時間點Ito各基因表達的變化，及普伐他汀對AMI后Ito表達的影響，為AMI后心律失常的藥物治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組

1.1.1 大鼠AMI模型的建立:SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心［SCXK(渝)2007-0001］提供，采用常規(guī)方法建立大鼠AMI模型［3］，假手術(shù)大鼠為前降支只穿線不打結(jié)。取成功手術(shù)大鼠20只，隨機分為4組，每組5只。其中4組分別為手術(shù)后24 h組、手術(shù)后1周組、手術(shù)后4周組、手術(shù)后4周加普伐他汀治療組(20 mg/kg每天灌胃1次，藥物購自上海三共制藥有限公司)及假手術(shù)組。后者15只，在前述3個時間點取心臟標本，每組5只。除普伐他汀組外其余各組均以等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.1.2 采集心臟標本:在10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉下迅速處死大鼠，取右室游離壁，在0.9%氯化鈉及0.1%DEPC水中清洗，置于液氮中保存。

1.2 Real-time PCR法檢測Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA

1.2.1 引物設(shè)計:使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物。kv1.4上游引物5'-GAATGACACCT CGGCACCC-3'，下游引物 5'-AAACTCAAAGGAAAA CCACACG-3'，長度106 bp;kv4.2上游引物5'-CTT CTGCTTGGATACCGCC-3'，下游引物5'-AGCCCAAT GTAATAGGGTAGGAT-3'，長度144 bp;Kv4.3 上游引物 5'-TGCCTGGGAGCAAGGAACT-3'，下游引物5'-CACTGCGGATGAAGCGGTA-3'， 長 度 144 bp。β-actin上游引物 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，長度150 bp。

1.2.2 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA相對表達量的檢測:取右室心肌組織50～100 mg，采用Trizol試劑提取總RNA，取5 μL RNA模板行反轉(zhuǎn)錄成cDNA(反應(yīng)條件:25℃ 10 min，40℃ 60 min，70℃ 10 min)。擴增目的基因和管家基因(反應(yīng)參數(shù):93℃ 2 min，93 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 cycles)，其產(chǎn)物進行梯度稀釋用于標準曲線繪制，按照ShineSYBR Real time qPCR Mastermix試劑盒(上海閃晶生物公司)說明書進行熒光定量擴增目的基因和管家基因，擴增條件為94 ℃ 4 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，40個循環(huán)。根據(jù)Ct值讀出起始模板量后計算出目的基因的相對拷貝數(shù)。

1.3 Westernblot法檢測 Kv1.4、Kv4.2及 Kv4.3蛋白

取右室心肌組織約100 mg，按100 mg/mL加入RIPA全蛋白提取液(上海申能博彩公司)，加入10 μL PMSF，冰上勻漿30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液20 μL BCA測定蛋白濃度。其余上清液加入等量2×上樣緩沖液，于70℃加熱10 min，以10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育2 h，加入一抗(兔抗大鼠 Kv1.4、Kv4.3和 Kv4.2，0.8 mg/mL)，37℃、60 r/min搖動90 min，棄去一抗，用Tris-HCl緩沖鹽溶液洗滌3次，加入二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體，1∶1 000)37℃孵育1 h，棄去二抗，再用Tris-HCl緩沖鹽溶液洗滌3次。增強化學發(fā)光(ECL)顯影，置于凝膠圖像分析系統(tǒng)分析條帶吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA的表達

假手術(shù)組各時間點右室心肌Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA及蛋白質(zhì)表達無明顯差異。AMI后24 h，Kv1.4 mRNA表達開始增高，1周組、4周組與24 h組比較無明顯差異;Kv4.2 mRNA表達在AMI后24 h開始降低，4周組更低，1周組較24 h組比較無明顯差異;Kv4.3 mRNA表達在AMI后各時間點均降低，24 h組最低，1周組與4周組比較無明顯差異，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 各組mRNA表達水平Table 1 mRNA expression of each group(n=5)

2.2 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3蛋白質(zhì)的表達

Kv1.4蛋白質(zhì)表達在AMI后24 h開始增高，1周組、4周組與24 h組比較無明顯差異，普伐他汀組與4周組比較表達降低;而Kv4.2及Kv4.3蛋白質(zhì)在AMI后24 h開始降低，具體數(shù)據(jù)見表2，圖1。

表2 各組蛋白質(zhì)表達水平Table 2 Protein expression of each group(n=5)

2.3 普伐他汀組與 4周組 Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3 mRNA及蛋白質(zhì)表達水平的比較

普伐他汀組Kv1.4 mRNA及蛋白質(zhì)表達水平較4周組降低，而Kv4.2、Kv4.3 mRNA及蛋白質(zhì)表達水平較4周組增高，具體數(shù)據(jù)見表1，表2及圖1。

圖1 各組Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3蛋白質(zhì)表達Fig 1 Protein expression changes of Kv1.4，Kv4.2，Kv4.3

3 討論

Ito是控制心室肌細胞動作電位時程的主要電流［4］。Ito有兩種成分:慢成分(Kv1.4基因編碼)及快成分(Kv4.2、Kv4.3基因編碼)兩種。Ito在心臟中的分布具有明顯的組織特異性，心尖部大于基底部，心外膜大于心內(nèi)膜，研究發(fā)現(xiàn)藥物對Ito影響程度也和組織分布有關(guān)［5－6］。本研究選用大鼠右室心肌，其原因是在左室AMI后，右室代償功能起著重要作用，也同樣存在基因表達的變化，右室相對遠離梗死區(qū)域，可以避免取材時組織缺血本身對Ito表達的影響，而且右室游離壁壁薄，量相對較少，檢測時使用了全部右室標本，避免了Ito組織特異性分布對結(jié)果的影響。

AMI后心肌細胞的丟失引起心室重構(gòu)，Ito電流下降，心肌細胞復極不均一，導致心律失常的發(fā)生［7］。研究發(fā)現(xiàn)犬及大鼠 AMI后 Ito電流密度下降，Kv1.4表達增高，而 Kv4.2及 Kv4.3表達降低［8－9］，但未見 AMI后各時間點變化趨勢的報道。本文報道了大鼠AMI后 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3表達的變化趨勢，為AMI后Ito研究的時間點選取提供依據(jù)。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)水平及AngⅡ1型受體、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血漿游離脂肪酸的變化可以影響Ito的表達［10－11］，目前認為 AMI后 Ito表達變化的機制可能與AMI后循環(huán)及心肌局部AngⅡ增高及TNF表達增加所致。

他汀類藥物能抑制心肌梗死后心肌局部AngⅡ產(chǎn)生，使AngⅡ1型受體活性下調(diào)，抑制TNF的表達及抗心律失常等作用，抗心律失常的機制尚不明確。有報道阿托伐他汀可阻止Ito在單純?nèi)毖獣r持續(xù)減小的趨勢［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，普伐他汀能抑制 AMI后Kv1.4表達增高及Kv4.2、Kv4.3表達降低，其機制可能是他汀類藥物抑制心肌局部AngⅡ產(chǎn)生、下調(diào)AngⅡ1型受體活性、抑制TNF的表達使Kv4.3及Kv4.2 mRNA表達增加，從而反轉(zhuǎn)AMI后心肌細胞Ito的減少，減少AMI后復極不均一性，發(fā)揮AMI后抗心律失常的作用，但本實驗未同時進行心肌局部AngⅡ、AngⅡ1型受體活性及TNF的表達的檢測，其機制尚需進一步證實。

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