何丁文，殷嫦嫦，顧玉榮，陳偉才，矢慶明，殷 明*

(南昌大學1.第二附屬醫(yī)院骨一科;2.研究生院醫(yī)學部，江西南昌330006;3.九江學院分析與檢測實驗室，江西九江332000)

周圍神經(jīng)因自我修復能力差，損傷后常導致感覺、運動功能損害甚至殘疾，給社會和家庭帶來巨大損失和沉重的經(jīng)濟負擔，已成為全球所面臨的嚴峻健康問題之一［1］，細胞移植治愈為治愈周圍神經(jīng)損傷提供了可能。胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞等一直被認為是移植治療神經(jīng)疾病的首選細胞，但其來源及倫理道德限制了其大規(guī)模應(yīng)用［2］。近期研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有強大的自我增殖能力和多向分化潛能，不僅可向成骨細胞、成軟骨、成脂肪細胞分化，在特定條件下還可向神經(jīng)元樣細胞、星形膠質(zhì)樣細胞和少突膠質(zhì)樣細胞分化［3］，被作為周圍神經(jīng)組織工程的重點種子細胞進行研究。本研究應(yīng)用bFGF和EGF體外誘導大鼠BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化，探討其向神經(jīng)分化潛能及聯(lián)合誘導優(yōu)勢，為BMSCs移植治療周圍神經(jīng)疾患提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:清潔級4周齡SD大鼠4只，雌雄不限，合格證號:HNASLKJ20122049。

1.1.2 主要試劑:DMEM/F-12(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，胰蛋白酶、瓊脂糖、甘氨酸、SDS、TRIS(Solarbio 公司)，CD90-FITC、CD45-FITC單抗(eBioscience公司)，堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(Peprotech公司)，兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體(PL Laboratories公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)，預(yù)染彩虹蛋白Marker(Fermentas公司)，總蛋白提取試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)，GREENspin組織/細胞RNA快速提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，PCR試劑盒、DNA Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、純化和鑒定:全骨髓貼壁法分離BMSCs。P3代BMSCs常規(guī)消化離心后PBS重懸至細胞濃度為1×107/mL，100 μL每管分裝于EP管中，分別加入 CD90-FITC、CD45-FITC 單抗5 μL，室溫避光孵育30 min后流式細胞儀檢測。

1.2.2 BMSCs的誘導:P3代 BMSCs消化后按1.5×105/mL接種至6孔板，24 h后更換成含1%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液:1)對照組:不加生長因子;2)EGF組:添加20 ng/mL EGF;3)bFGF組:添加20 ng/mL bFGF;4)EGF+bFGF組:添加20 ng/mL EGF和bFGF。倒置相差顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 Western blot檢測NSE、GFAP蛋白表達水平:誘導7 d后，按細胞總蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，制備 SDS-PAGE 凝膠后上樣30 μg，70～120 V恒壓電泳，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜70 min，5% ～20%脫脂牛奶封閉2～4 h，4℃孵育一抗 NSE抗體(1∶100)、GFAP 抗 體 (1∶1 000)及 GAPDH 抗 體(1∶2 000)過夜，洗膜，孵育二抗(1∶4 000)，顯影、定影，用Image J吸光度分析軟件對蛋白條帶進行分析。

1.2.4 RT-PCR檢測NSE、GFAP mRNA表達水平:誘導7 d后，按RNA快速提取說明書提取各組細胞總RNA，按說明書進行反轉(zhuǎn)錄和擴增后電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相，Image J軟件分析，結(jié)果以 NSE區(qū)帶/GAPDH區(qū)帶的相對吸光度值和GFAP區(qū)帶/GAPDH區(qū)帶的相對吸光度值表示，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(表1)。

表1 RT－PCR引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 RT－PCR primer sequence of target gene and product size

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs分離、純化及鑒定

原代培養(yǎng)9～12 d左右可達80% ～90%匯合(圖1A)，P3代BMSCs呈典型的長梭形或扁平形，緊密漩渦樣排列(圖1B)。細胞表面骨髓基質(zhì)標志CD90高達 98.72%，而造血細胞標志 CD45僅1.05%(圖2)。

2.2 BMSCs神經(jīng)分化后形態(tài)學觀察

圖3 bFGF和EGF誘導后BMSCs形態(tài)變化Fig 3 BMSCs morphological changes induced by bFGF and EGF

EGF、bFGF及EGF+bFGF組誘導3 d后部分細胞體積變小，立體感增強(圖3A);7 d后bFGF和EGF+bFGF組細胞折光性增強，胞體為圓形或橢圓形，見簡單的雙極和復雜的多極細胞，向周圍伸出突起并分支，呈典型的神經(jīng)元樣細胞形態(tài)(圖3D、E)，相鄰的突起間存在連接(圖3F)，EGF組僅見簡單的雙極、三極細胞(圖3C)，而對照組罕見類似細胞(圖3B)。

2.3 Western blot檢測結(jié)果

EGF組、bFGF組和 EGF+bFGF組 NSE、GFAP蛋白表達高于對照組，bFGF組和EGF+bFGF組高于EGF組，且EGF組高于空白對照組，EGF+bFGF組高于bFGF組(P＜0.05)(圖4，表2)。

表2 誘導7 d各組NSE和GFAP蛋白相對表達水平Table 2 Relative expression of NSE and GFAP collagens in each group at 7 days after induction(x ± s，n=3)

圖4 bFGF和EGF對骨髓間充質(zhì)干細胞NSE和GFAP蛋白表達的影響Fig 4 Electrophoresis of NSE and GFAP proteins expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by bFGF and EGF

2.4 RT-PCR檢測結(jié)果

NSE、GFAP在 EGF組、bFGF組和 EGF+bFGF組均高于對照組，bFGF組和 EGF+bFGF組高于EGF組，且EGF組高于對照組(P＜0.05);EGF+bFGF組NSE高于bFGF組(P＜0.05);EGF+bFGF組GFAP與bFGF組無明顯差異(圖5)。

3 討論

圖5 bFGF和EGF對骨髓間充質(zhì)干細胞NSE和GFAP mRNA表達的影響Fig 5 NSE and GFAP mRNA expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by bFGF and EGF

BMSCs是一類未分化的具有多向分化潛能的成體干細胞，在特定條件下可向神經(jīng)表型分化［3］，目前常用的神經(jīng)定向誘導劑主要為抗氧化劑和生長因子［4］，在各種誘導方法中化學誘導法分化快，但細胞壞死較多，細胞生長狀態(tài)差于生長因子誘導法［5］，生長因子中bFGF、EGF的研究最多且應(yīng)用最廣泛，bFGF在胚胎期和成年期的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中均有表達，維持神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的存活，促進交感和副交感神經(jīng)元的軸突生長，能促進損傷神經(jīng)的修復和突起生長［6］;bFGF是腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞-12(Adrenal pheochromocytoma cells-12，PC12)神經(jīng)突起延伸、人NPCs神經(jīng)再生及誘導神經(jīng)細胞分化的重要生長因子［7］。EGF在神經(jīng)系統(tǒng)中可促進神經(jīng)元軸突的延長和維持神經(jīng)元的存活，具有絲裂原樣作用，可促進 BMSCs分化增殖［8］。bFGF、EGF對神經(jīng)前體細胞增殖具有協(xié)同作用［9］，對胚胎源性神經(jīng)干細胞在分化方向上的作用有明顯差異，bFGF干預(yù)后的子代細胞大多數(shù)表達神經(jīng)元特異性抗原標記NSE、微管相關(guān)蛋白2(mirotubulin-associated protein 2，MAP2)等［7］，而 EGF 作用的子代細胞大多數(shù)為膠質(zhì)樣細胞［10］，聯(lián)合作用時以成神經(jīng)元樣細胞為主，對BMSCs的誘導可得到上述相同結(jié)果［11］。這些研究結(jié)果表明生長因子的作用取決于作用的細胞類型、細胞分化階段及其輔助因子［7］。在神經(jīng)系統(tǒng)中NSE為成熟神經(jīng)元特異性標志物［13］，GFAP 為星形膠質(zhì)細胞的特異性標志物［14］。本研究應(yīng)用bFGF和EGF誘導BMSCs成神經(jīng)分化，細胞形態(tài)呈典型的神經(jīng)元樣細胞形態(tài)，部分相鄰的突起間存在連接，尤以EGF+bFGF組最為顯著。誘導后bFGF組和EGF+bFGF組NSE和GFAP蛋白及其mRNA顯著高于EGF組，且EGF+bFGF組NSE蛋白和mRNA表達量最高。從蛋白及mRNA水平發(fā)現(xiàn)對照組 BMSCs也表達 NSE、GFAP，說明BMSCs具有表達神經(jīng)和膠質(zhì)細胞標志物的能力。

bFGF和EGF可促進大鼠BMSCs向神經(jīng)細胞分化，聯(lián)合應(yīng)用時效果最顯著，但各組所得神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞比例不同，且bFGF誘導BMSCs向神經(jīng)分化的能力強于EGF。另外，盡管本實驗從細胞形態(tài)、特異性標志及mRNA方面證明了神經(jīng)細胞的形成，但所得細胞是否存在功能不能完全依賴于此，如細胞之間的連接是否為突觸聯(lián)系、相連的神經(jīng)突起中是否有釋放神經(jīng)遞質(zhì)的突觸小泡及神經(jīng)元樣細胞是否有神經(jīng)電位等問題均需進一步研究證明。

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