左 偉，吳志宏，蘇新林，吳 南，邱貴興

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京100730)

由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管和神經(jīng)支配，僅含有單一的軟骨細胞，導致關(guān)節(jié)軟骨損傷后自身修復能力很差。關(guān)節(jié)軟骨損傷最終會導致軟骨的剝脫，關(guān)節(jié)面不完整，給患者造成關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及活動障礙等極大痛苦。目前，軟骨損傷的修復已成為骨科醫(yī)生的一項挑戰(zhàn)，組織工程學的提出為軟骨缺損的修復重建提供了新的治療途徑，但如何獲得適合的種子細胞是軟骨組織工程的關(guān)鍵。除了骨髓間充質(zhì)干細胞，近年來已有學者從人的脂肪、皮膚、滑膜甚至椎間盤組織中分離出成體干細胞［1－4］，但關(guān)于軟骨來源成體干細胞的研究還比較少，本研究旨在觀察關(guān)節(jié)軟骨中是否存在有軟骨干細胞，并對軟骨干細胞進行分離、培養(yǎng)和鑒定，以期為將來的組織工程學提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Hycolon公司);成脂肪、成骨、成軟骨誘導培養(yǎng)基(R＆D公司);纖連蛋白，油紅O，茜素紅和甲苯胺藍(Sigma公司);CD45，CD90，CD73等流式檢測抗體(BD公司);堿性磷酸酶檢測試劑盒(碧云天公司);Ⅱ型膠原和蛋白多糖(Aggrecan)抗體(Abcam公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 軟骨干細胞的分離與培養(yǎng):選擇2011年10月至2012年4月在北京協(xié)和醫(yī)院行膝關(guān)節(jié)表面置換手術(shù)的晚期骨關(guān)節(jié)炎患者6例，其中男性2例，女性4例，年齡63.2±3.5歲。經(jīng)患者同意、醫(yī)院倫理委員會許可，收集手術(shù)后廢棄的軟骨組織，用剪刀將軟骨剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.2%Ⅱ型膠原蛋白酶，37℃水浴搖床消化8 h后，70μm濾網(wǎng)過濾得到單個軟骨細胞。將軟骨細胞以4×103個/mL的密度接種至預先用10μg/mL纖連蛋白處理過的平皿中，20 mins后給予換液以去除未貼壁的細胞，然后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。兩周后，用克隆環(huán)挑取平皿中所形成細胞數(shù)大于32的單個集落，放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，具體方法可參考文獻［5］。

1.2.2 流式細胞儀檢測:取生長狀態(tài)良好的第3代軟骨干細胞，胰蛋白酶消化后細胞計數(shù)板計數(shù)，每檢測樣本細胞量大約為2×105個。重懸細胞后加入適當濃度的流式檢測抗體，4℃避光孵育30 mins。PBS洗滌2次后，用300μL PBS重懸，上流式細胞儀檢測軟骨干細胞表面CD分子表達情況，同時用PBS作為一抗設置陰性對照。

1.2.3 軟骨干細胞的成脂誘導及鑒定:選擇第3代軟骨干細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后以5×104個細胞數(shù)接種于12孔板中，常規(guī)培養(yǎng)細胞貼壁至90%匯合后改為成脂誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，每72 h給予換液，同時設置普通培養(yǎng)基培養(yǎng)為陰性對照。誘導3周4%多聚甲醛固定后行油紅O染色。

1.2.4 軟骨干細胞的成骨誘導及鑒定:選擇第3代軟骨干細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后以5×104個細胞數(shù)接種于12孔板中，常規(guī)培養(yǎng)細胞貼壁匯合至80%后改為成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔72 h給予換液，同時設置普通培養(yǎng)基培養(yǎng)為陰性對照。誘導3周4%多聚甲醛固定后行茜素紅染色及堿性磷酸酶活性測定。

1.2.5 軟骨干細胞的成軟骨誘導及鑒定:選取第3代軟骨干細胞，胰蛋白酶消化后將1×106個細胞吸入到15 mL離心管中，經(jīng)離心后形成細胞微團，給予成軟骨誘導培養(yǎng)基進行誘導分化，每72 h換液1次，同時設置普通培養(yǎng)基培養(yǎng)為陰性對照。誘導4周后，4%多聚甲醛固定，常規(guī)組織包埋、切片，行甲苯胺藍染色，并行誘導后組織的Ⅱ型膠原及Aggrecan免疫組化檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差)表示。

2 結(jié)果

2.1 軟骨干細胞的分離與培養(yǎng)

軟骨組織消化后的單個細胞接種到纖連蛋白處理過的平皿20 mins后，部分細胞即開始貼壁。在后期的培養(yǎng)中，細胞呈集落樣生長，至2周時，已有較大集落的形成，部分集落與集落間相互匯合，細胞呈短梭形。經(jīng)克隆環(huán)挑取細胞集落繼續(xù)培養(yǎng)后，細胞生長迅速，3～4 d即可傳1代。傳至第3代時，細胞形態(tài)均一，呈長梭形或多角形(圖1)。

2.2 流式細胞儀檢測軟骨干細胞表面標志物

大部分軟骨干細胞表面表達 CD44、CD29、CD73、CD90和 CD166，但幾乎不表達 CD45、CD34和 CD133(圖2)。

2.3 成脂肪誘導及其鑒定

在成脂誘導過程中，可以發(fā)現(xiàn)誘導后的細胞變大，胞核周圍出現(xiàn)空泡樣小脂滴顆粒，約2周后脂滴增大并相互融合。行油紅O染色，可見細胞內(nèi)有大量紅色脂滴，而普通培養(yǎng)基培養(yǎng)組則無明顯脂滴形成(圖3)。

2.4 成骨誘導及其鑒定

軟骨干細胞經(jīng)成骨誘導后，可以發(fā)現(xiàn)細胞變成多角形，細胞內(nèi)顆粒逐漸增多，細胞間可見有鈣質(zhì)沉積，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶檢測也可發(fā)現(xiàn)細胞呈陽性表達;普通培養(yǎng)基培養(yǎng)組則無明顯鈣質(zhì)沉積，堿性磷酸酶檢測發(fā)現(xiàn)細胞呈陰性或弱陽性表達(圖4)。

2.5 成軟骨誘導及其鑒定

細胞在15 mL離心管經(jīng)離心后48 h，即可發(fā)現(xiàn)細胞聚集成不規(guī)則團塊樣，隨著誘導時間的延長，誘導組細胞團塊逐漸增大，變成球狀，表面也變得光滑。培養(yǎng)4周后，可見誘導組的軟骨團塊大于普通培養(yǎng)基培養(yǎng)組，誘導后軟骨組織包埋切片，可以發(fā)現(xiàn)甲苯胺藍染色呈陽性，經(jīng)免疫組化檢測，誘導后的軟骨組織也可表達Ⅱ型膠原和Aggrecan(圖5)。

3 討論

目前，針對有癥狀關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復已成為一種趨勢，軟骨組織工程的提出，為大面積的軟骨缺損修復提供了新的途徑。理論上，自體軟骨細胞是構(gòu)建軟骨最為理想的種子細胞，但人體內(nèi)軟骨細胞來源非常有限，且在體外培養(yǎng)過程中，軟骨細胞增殖能力較弱，也極易發(fā)生老化及去分化，喪失形成軟骨的能力［6－7］。有學者以骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞在體外構(gòu)建組織工程軟骨，但發(fā)現(xiàn)所形成的是一些類軟骨樣組織，其生物學性能明顯不如正常軟骨［8－9］。本研究試想，如果能從關(guān)節(jié)軟骨中分離、鑒定出軟骨干細胞，一方面能為軟骨組織工程提供良好的種子細胞，另一方面也可能為軟骨損傷的原位修復治療提供新的希望。

圖5 軟骨干細胞的成軟骨誘導Fig 5 Chondrogenic differentiation in cartilage-derived stem cells

本實驗依據(jù)干細胞貼壁生長形成單個集落的特性成功分離出軟骨干細胞，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)軟骨干細胞表面表達 CD44、CD29、CD73、CD90和CD166等分子，且?guī)缀醪槐磉_ CD45、CD34和CD133。在體外誘導分化實驗中發(fā)現(xiàn)，軟骨干細胞能成功向脂肪細胞和骨細胞進行分化;當給與成軟骨誘導培養(yǎng)基時，軟骨干細胞能聚集成團，免疫組化結(jié)果顯示，誘導后的組織能成功表達Ⅱ型膠原及Aggrecan，Ⅱ型膠原和Aggrecan是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的主要成分，這說明在軟骨誘導培養(yǎng)基的作用下，軟骨干細胞能成功的向軟骨細胞進行分化。根據(jù)國際干細胞治療協(xié)會的標準［10］，本研究分選出的細胞滿足了絕大部分對干細胞定義的要求。

總的來說，本研究認為軟骨中存在著軟骨干細胞，并成功的對軟骨干細胞進行了鑒定，從而可能為軟骨組織工程提供了新的種子細胞來源，也為軟骨損傷的原位修復提供了希望，但對軟骨干細胞的生物學特性，還需要進一步的研究。

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