王衛(wèi)民，丁妍

(1.湖北十堰市太和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，湖北十堰 442000;2.湖北十堰市太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所，湖北十堰 442000)

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是來(lái)源于人臍帶基質(zhì)Whaton's jelly的一種干細(xì)胞，表達(dá)MSC的表面標(biāo)志CD105、CD90及 CD44。最近的一些研究表明，hUC-MSCs具有免疫抑制及抑制T細(xì)胞增殖的作用［1］。而且hUC-MSCs抑制還能改善缺血性休克以及由多巴胺能神經(jīng)元損傷和脊髓損傷而導(dǎo)致的帕金森?。?］，保護(hù)新生鼠腦白質(zhì)軟化灶的神經(jīng)［3］。

目前，關(guān)于MSCs體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的報(bào)道較多，誘導(dǎo)方法各異，結(jié)果也不盡相同［4］。只有尋找到最簡(jiǎn)便、快速、毒性低的誘導(dǎo)途徑，才能使hUCMSCs的臨床應(yīng)用真正變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。丁基羥基茴香醚(butyl hydroxyanisole，BHA)是一種很好的抗氧劑，本研究探討其是否能在體外將hUC-MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，以期找到相對(duì)較適合的誘導(dǎo)條件，為hUC-MSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

低糖 DMEM、胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶(Gibco)，L-谷氨酰胺(Sigma)，碘化丙啶(PI，Sigma)，小鼠抗人巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)及神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(美國(guó)Santa)，Cy3標(biāo)記的羊抗鼠二抗、FITC-標(biāo)記的羊抗鼠二抗(北京天根生物技術(shù)有限公司)，BHA、DMSO(美國(guó)Sigma)，RT-PCR試劑盒(安特捷)。

1.2 hUC-MSCs的培養(yǎng)

培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS，細(xì)胞鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)瓶的底部即用0.05%胰蛋白酶/0.04%EDTA消化、分離傳代，大約每3～4 d傳代1次，本實(shí)驗(yàn)中所用到的細(xì)胞為P4～P6。

1.3 體外定向誘導(dǎo)hUC-MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化

將3至5代的細(xì)胞懸液接種于直徑40 mm塑料培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%至90%融合時(shí)開(kāi)始進(jìn)行誘導(dǎo)分化。實(shí)驗(yàn)組:先用DMEM培養(yǎng)基加10%FBS加1 mmol·L－1巰基乙醇(β-ME)誘導(dǎo) 24 h，再換成DMEM培養(yǎng)基加2%DMSO 加200 μmol·L－1BHA 加2 mmol·L－1β-ME 誘導(dǎo)72 h。對(duì)照組:不加任何誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)過(guò)程中在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 鑒定分化的神經(jīng)樣細(xì)胞

1.4.1 RT-PCR鑒定 分別于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后1 d、誘導(dǎo)后3 d收集細(xì)胞，提取總RNA(Trizol法)，RT-PCR按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，引物序列、產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.2 免疫熒光鑒定 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞誘導(dǎo)1、3 d后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物巢蛋白、神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物NSE及星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。具體染色步驟如下:PBS(pH 7.4)洗滌細(xì)胞;4%多聚甲醛固定30 min以上，PBS洗滌3次，每次5 min;非免疫性動(dòng)物血清封閉，室溫10 min;分別滴加巢蛋白單抗(1∶50)、NSE 單抗(1∶50)、GFAP 單抗(1∶50)，4 ℃過(guò)夜;PBS沖洗3次，每次5 min;滴加二抗:Cy3標(biāo)記或FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃孵育60 min，PBS沖洗3次，每次3 min;Hoechst 33342染核5～10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié) 果

2.1 加入誘導(dǎo)液后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化

本實(shí)驗(yàn)中加入BHA進(jìn)行誘導(dǎo)后12 h開(kāi)始有少量細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化:原本寬大而扁平的細(xì)胞開(kāi)始變小，胞體變圓變亮，折光性增強(qiáng)，開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)小的突起;誘導(dǎo)24 h后，大部分細(xì)胞發(fā)生類(lèi)似上述形態(tài)改變;72 h后呈現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)，相鄰的細(xì)胞間軸突聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀，誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)不一，有簡(jiǎn)單的雙極細(xì)胞，也有復(fù)雜的多極細(xì)胞。少數(shù)誘導(dǎo)細(xì)胞胞體較大，突起較多，較獨(dú)立存在，類(lèi)似膠質(zhì)細(xì)胞。有少部分細(xì)胞始終未發(fā)生形態(tài)改變，仍保持寬大扁平狀。熒光染色巢蛋白、GFAP及NSE均為陽(yáng)性，但NSE陽(yáng)性細(xì)胞最多，達(dá)90%以上，巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞次之，約50%，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞極少，不到1%(圖1)。

2.2 RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)各基因的表達(dá)情況

誘導(dǎo)前MSC表達(dá)少量的巢蛋白，誘導(dǎo)24 h后巢蛋白表達(dá)升高，同時(shí)開(kāi)始有MAP2及NF-L表達(dá);誘導(dǎo)72 h后巢蛋白及NF-L表達(dá)較24 h有所降低，但MAP-2表達(dá)明顯升高，而且NeuroD1也有較高表達(dá)。見(jiàn)圖2。

3 討 論

雖然骨髓是MSCs的主要來(lái)源，但是利用骨髓來(lái)源的細(xì)胞并不總是可取的，因?yàn)楣撬璨杉旧砭褪且粋€(gè)有創(chuàng)的操作，該過(guò)程中病毒的暴露率、捐獻(xiàn)者發(fā)病率都會(huì)升高，而且細(xì)胞的數(shù)量、增殖能力、分化能力都會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而降低。而臍帶為分娩后廢棄物，hUC-MSCs的獲取過(guò)程為非侵襲性操作，無(wú)倫理限制，相關(guān)污染率也遠(yuǎn)低于骨髓來(lái)源MSCs，因此hUC-MSCs成為臨床上最具應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞［5］。

目前用于誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的因子主要有維甲酸(retinoicacid，RA)［6］、細(xì)胞生長(zhǎng)因子 bFGF 和EGF、去甲基試劑5-氮胞苷和生長(zhǎng)因子以及noggin［7］。此外一些具有抗氧化特性的中藥如丹參注射液［8］、麝香多肽［9］等也可誘導(dǎo) MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。BHA是抗氧化劑，能促進(jìn)谷胱甘肽的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化［10］。β-ME能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中的存活，促進(jìn)軸突的顯著增長(zhǎng)，促進(jìn)谷胱甘肽的合成，清除氧自由基［11］。已有研究報(bào)道β-ME和BHA能誘導(dǎo)人胎肝CD34+細(xì)胞［12］及表觀修飾后的NIH/3T3細(xì)胞［13］分化為神經(jīng)細(xì)胞，因而我們?cè)O(shè)想這兩種因子也能快速地將hUC-MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞。

圖1 BHA誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化及免疫熒光檢測(cè) A.對(duì)照組相差顯微鏡下不同時(shí)間細(xì)胞形態(tài)保持不變，細(xì)胞密度增加 ×40;B.誘導(dǎo)組相差顯微鏡下不同時(shí)間細(xì)胞形態(tài)變化 ×100;C.免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因巢蛋白、GFAP及NSE ×100

圖2 誘導(dǎo)前后神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)情況 A～C為RT-PCR電泳圖;D為A～C的直方圖

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用β-ME及抗氧化劑BHA誘導(dǎo)hUCMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。誘導(dǎo)72 h后發(fā)現(xiàn)，有較多的分化細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物NSE，少量分化細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GEAP。NSE是神經(jīng)細(xì)胞特異標(biāo)志之一，在神經(jīng)發(fā)育的早、中、晚期均表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)24及72 h時(shí)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物巢蛋白、NF-L、MAP-2及NeuroD1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)24 h后巢蛋白的表達(dá)率較高，72 h后有所下降，表明神經(jīng)干細(xì)胞在誘導(dǎo)過(guò)程中逐漸分化為神經(jīng)細(xì)胞而數(shù)量逐漸減少。NF-L的表達(dá)量24 h時(shí)升高，72 h時(shí)下降，而MAP2和NeuroD1的表達(dá)量逐漸增多。巢蛋白和NFL是在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的中間絲蛋白，是神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)記［14］。BHA誘導(dǎo)hUCMSCs分化為神經(jīng)元的過(guò)程為:先使其分化為神經(jīng)干細(xì)胞，然后再進(jìn)一步分化為成熟的神經(jīng)元。因而在誘導(dǎo)初期巢蛋白和NF-L的表達(dá)量增多，隨后又下降。MAP2是神經(jīng)細(xì)胞特異微管相關(guān)蛋白，能使神經(jīng)細(xì)胞維持正常的形態(tài)和功能，是成熟神經(jīng)元特有的結(jié)構(gòu)，位于神經(jīng)元的胞體和樹(shù)突，出現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育晚期及成年期，有穩(wěn)定神經(jīng)元微管和保持神經(jīng)元形態(tài)的作用［15］;NeuroD1是一種神經(jīng)元分化因子。這二者都是神經(jīng)元特異性的標(biāo)志，隨著誘導(dǎo)的進(jìn)行，分化成熟的神經(jīng)元越來(lái)越多，因而其表達(dá)量是逐漸增多的。

綜上所述，β-ME和BHA能快速將hUC-MSCs分化為神經(jīng)元。但是分化而成的神經(jīng)元是否具有功能?這一問(wèn)題我們將在后續(xù)的研究中進(jìn)行探討。關(guān)于β-ME和BHA誘導(dǎo)hUC-MSCs分化為神經(jīng)元的具體機(jī)制目前尚不得而知，可能與其抗氧化、促進(jìn)谷胱甘肽的合成及誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化有關(guān)。

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