李龍，張紅，唐發(fā)兵，楊蘭生

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科，甘肅蘭州 730000;2.甘肅省第二人民醫(yī)院急診科，甘肅蘭州 730000;3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院病理科，甘肅蘭州 730000)

肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的疾病。近年來(lái)世界各國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率逐漸上升，而這種疾病的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明了。本研究擬通過(guò)對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、RAS/MARK信號(hào)通路活化蛋白ERK1/2在肺部正常組織和惡變組織中表達(dá)的研究，探討EGFR、ERK1/2在肺癌發(fā)病機(jī)制中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選用蘭州大學(xué)第一醫(yī)院2008年10月至2011年12月間胸外科手術(shù)及呼吸內(nèi)科纖維支氣管鏡活檢肺癌組織標(biāo)本36份，均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診;男22例，女14例，年齡34～78歲，平均58歲;其中鱗癌17例，腺癌9例，小細(xì)胞癌10例，均為未接受化療、放療或其他抗癌治療的初治病例。同時(shí)各取同一病人距癌變組織＞5 cm的外周非惡變組織1份共計(jì)36份。另取非惡性肺組織標(biāo)本14份，其中普通炎癥5例，正常肺組織9例，男10例，女4例，年齡32～71歲，平均56歲。標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定，常規(guī)脫水包埋，5 μm連續(xù)切片，分別行常規(guī)HE染色和免疫組化染色。

1.2 主要試劑

LSAB試劑盒購(gòu)自丹麥DAKO公司;抗體EGFR和ERK1/2均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology Inc(北京中山生物技術(shù)有限公司分裝)，工作濃度分別為1∶120和1∶100;3，3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購(gòu)自華美公司;稀釋緩沖液為0.05 mol·L-1TBS(pH 7.4)。

1.3 方法

免疫組化(LSAB法)染色參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 染色判定

光鏡下隨機(jī)觀察8個(gè)高倍視野，記錄4個(gè)高倍視野中染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。采用單盲法閱片，顯微鏡下細(xì)胞膜呈棕褐色或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色細(xì)顆粒狀為表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，被染色的細(xì)胞數(shù)≥整個(gè)細(xì)胞數(shù)的25%定為陽(yáng)性，＜25%定為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

14例非惡性肺組織中僅1例EGFR弱陽(yáng)性表達(dá)，ERK1/2無(wú)表達(dá)，肺癌組織及遠(yuǎn)癌肺組織 EGFR和ERK1/2表達(dá)均較高，與非惡性肺組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，詳見(jiàn)表1和圖1～4。

表1 不同組織中EGFR、ERK1/2表達(dá)情況比較 份

圖1 EGFR在肺腺癌中的表達(dá) HE×200

圖2 EGFR在慢性炎肺組織中的表達(dá) HE×200

圖3 ERK1/2在肺腺癌中的表達(dá) HE×200

圖4 ERK1/2在慢性炎肺組織中的表達(dá) HE×200

36例肺癌標(biāo)本中，26例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本的EGFR陽(yáng)性率(21/26，80.8%)顯著高于10例小細(xì)胞肺癌標(biāo)本(2/10，20.0%)(P＜0.05)。ERK1/2陽(yáng)性率與肺癌類(lèi)型無(wú)明顯關(guān)系，非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本為65.4%(17/26)，小細(xì)胞肺癌標(biāo)本為80.0%(8/10)，兩者比較，P ＞0.05。

36例肺癌標(biāo)本中，EGFR與ERK1/2共陽(yáng)性21例(占58.3%)，共陰性10例(27.8%)，兩者表達(dá)有明顯相關(guān)性，r=0.551，P ＜0.01。

3 討 論

已經(jīng)證實(shí)，EGFR家族與配體結(jié)合后，激活其酪氨酸激酶，使自身酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)一步促發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)，如細(xì)胞分裂與增殖等［1-2］。異常表達(dá)的EGFR常與許多增生性疾病如實(shí)體腫瘤(多見(jiàn)于非小細(xì)胞肺癌等)相關(guān)，通常提示疾病的預(yù)后不良［3］。本研究顯示，在癌變組織以及遠(yuǎn)癌肺組織中，EGFR陽(yáng)性表達(dá)率較高，與非惡性肺組織差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，這與EGFR基因突變密切相關(guān)［4］。

本研究36例肺癌標(biāo)本中，非小細(xì)胞肺癌EGFR陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于小細(xì)胞肺癌，與文獻(xiàn)報(bào)道的EGFR主要在腺、鱗癌中陽(yáng)性率高，而小細(xì)胞肺癌EGFR大多為陰性相一致，說(shuō)明EGFR與非小細(xì)胞肺癌關(guān)系更為密切。

為進(jìn)一步揭示肺癌發(fā)生的機(jī)制，本研究通過(guò)各組標(biāo)本中ERK1/2的表達(dá)來(lái)檢測(cè)RAS/MARK信號(hào)通路活化狀況。RAS/MARK信號(hào)通路是EGFR活化的一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，ERK1/2蛋白是這條通路上的關(guān)鍵蛋白，ERK1/2通過(guò)一系列磷酸化后，可以將多種細(xì)胞外刺激產(chǎn)生的信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡［5-6］。免疫組化檢測(cè)到ERK1/2蛋白通常表示RAS/MARK信號(hào)通路的活化。本研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)癌肺組織中有ERK1/2蛋白的高表達(dá)(且與肺癌組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，提示這些遠(yuǎn)癌肺組織中有RAS/MARK信號(hào)通路的活化。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，ERK1/2表達(dá)與肺癌組織學(xué)類(lèi)型無(wú)明顯相關(guān)性，從而提示RAS/MARK信號(hào)通路活化在肺癌病變中可能是普遍的。

同時(shí)本研究顯示，EGFR陽(yáng)性的肺癌組織中常有較高ERK1/2基因的表達(dá)，兩者之間有顯著相關(guān)性(r=0.551)。有研究發(fā)現(xiàn)63%的高表達(dá)EGFR的肺癌細(xì)胞可檢測(cè)到基因突變。研究表明，細(xì)胞EGFR高表達(dá)時(shí)，常同時(shí)合并其它基因的異常。EGFR高表達(dá)的肺癌細(xì)胞常合并有ERK1/2基因突變，兩者同時(shí)表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［7］。還有研究［8-9］表明，ERK信號(hào)通路參與腫瘤血管生成，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲。推測(cè)可能ERK1/2基因的突變與造成EGFR基因的重排有關(guān)，從而使EGFR在細(xì)胞膜表面表達(dá)增多，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

本研究表明，鑒于小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌EGFR表達(dá)水平的顯著差異，因此，可通過(guò)測(cè)定癌組織中EGFR表達(dá)水平以幫助一些病理學(xué)難以分類(lèi)的肺癌進(jìn)行分型;同時(shí)，對(duì)于 ERK活性增高的腫瘤，利用RNA干擾技術(shù)剔除ERK，降低ERK蛋白表達(dá)，或利用MEK抑制劑抑制ERK活性，控制ERK過(guò)度磷酸化，均能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng);以ERK為靶點(diǎn)可開(kāi)發(fā)對(duì)抗腫瘤藥物，為預(yù)防和治療惡性腫瘤提供新思路。

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