王秋霜，凌彩金，劉淑媚，趙超藝，李家賢

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣東廣州510640)

花青素(anthocyanidin)又叫花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬類黃酮化合物，是構(gòu)成花瓣和果實顏色的主要色素之一。花青素不僅使花卉、水果和蔬菜呈現(xiàn)美麗的顏色，還賦予更高的功能性。花青素具有延緩衰老、抗氧化［1－4］、抗突變［5］、抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生［6］、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟、降低 DNA 氧化損害［7］、降血糖［8］等多種生理功能。天然色素與合成色素相比安全性高，且具有一定的營養(yǎng)和藥理作用［9］。因此，開發(fā)利用天然色素資源日益受到人們的重視。提取、分離、純化是功能性物質(zhì)研究的第一步，因此本文將對該領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 花青素的基本概況

花青素存在于很多植物中，如紅葡萄、草莓、藍(lán)莓、茄子、紫薯等等?；ㄇ嗨卮蟛糠侄际撬苄陨?，是果實、植株、花呈現(xiàn)出紅、橙、紫、藍(lán)等顏色的重要原因［10］?；ㄇ嗨貙兕慄S酮化合物，基本結(jié)構(gòu)單元為α－苯基苯并吡喃型陽離子(圖1)，因3’及5’位置的取代基不同(羥基或甲氧基)，形成了各種各樣的花青素［11］?，F(xiàn)已知的花青素有20多種，主要存在于植物中的有6種:天竺葵素(pelargonidin)、矢車菊素或芙蓉花色素(cyanidin)、翠雀素或飛燕草色素(delphindin)、芍 藥 素 (peonidin)、錦 葵 色 素(Malvidin)及牽?；ㄉ?Petunidin)等［12］。有研究認(rèn)為，在發(fā)酵和未發(fā)酵茶葉中已經(jīng)鑒定的花青素主要是前五種，其中最主要的是錦葵色素［10］。楊賢強(qiáng)等［13］發(fā)現(xiàn)，茶葉中花青素主要有四種，除了上述的前3種外還包括翹搖紫苷元(三策啶)。

此外，茶葉中還存在原花色素(proanthocyanidins)，由花白素和兒茶素聚合而成，酸性條件下兩類物質(zhì)可部分轉(zhuǎn)化為花青素［11］。自然條件下，游離的花青素主要以糖苷形式存在，花青素與葡萄糖鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花色苷，已知天然的花色苷有250多種［11］。

花青素可以隨著細(xì)胞液的酸堿度而改變顏色:細(xì)胞液呈酸性則偏紅，細(xì)胞液呈堿性則偏藍(lán)。因為茶葉細(xì)胞顯酸性，因此葉片顯現(xiàn)紅色?；ㄇ嗨卦谄胀ǖ木G色芽葉中僅含0.1%，紅紫色芽葉中含量高達(dá)1%以上［14］。低溫時，有些植物的莖葉會變成紫紅色，這是因為葉片里的碳水化合物轉(zhuǎn)變成花青素的緣故，秋天的紅葉也是葉片的花青素引起的。光可增加花青素含量，高溫會使花青素降解。

2 花青素分離純化方法研究進(jìn)展

從植物中分離、純化得到花青素類物質(zhì)并應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域已經(jīng)成為花青素研究的新熱點。

圖1 花青素基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of anthocyanidin

由于花青素分子具有酸性與堿性基團(tuán)，因此較易溶于水、酸堿及有機(jī)醇溶劑中［11］。因此，花青素一般可以用極性溶劑來提取。傳統(tǒng)的提取方法是在低沸點的醇類中添加鹽酸，如使用酸性乙醇［15－19］;也有不加酸，僅僅用乙醇來提?。?0－21］。但是，有學(xué)者研究認(rèn)為添加鹽酸可能引起花青素的分解［22］。因此，現(xiàn)在有學(xué)者提倡使用丙酮添加弱有機(jī)酸，但丙酮有一定的毒性，因此應(yīng)用并不廣泛［23］?；ㄇ嗨卦谳^強(qiáng)的酸性條件下相對穩(wěn)定，在提取液中有必要添加酸來維持其穩(wěn)定性。但是，添加酸的種類不同對花青素本身會產(chǎn)生影響，強(qiáng)酸可能引起糖苷鍵的斷裂，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性［24］。

提取的方法主要包括超聲波輔助萃?。?5］、微波萃取［16，18，20］、水浴加熱萃取等。提取條件的研究較多，包括酸的濃度(pH)、醇濃度、浸提時間、浸提溫度、料液比、提取次數(shù)等;在單因素實驗基礎(chǔ)上通過正交或者二次旋轉(zhuǎn)回歸方法對提取因素進(jìn)行優(yōu)化。

Kerio［10］等研究人員采用甲醇－鹽酸提取茶葉中的花青素。茶樹中有一類特殊的資源，即新生的芽葉呈現(xiàn)出紅紫色，主要是內(nèi)含花青素的原因。常溫下提取4h，然后濃縮、凍干，通過SPE固相萃取柱進(jìn)行純化，然后進(jìn)入液相色譜儀分析。國內(nèi)有學(xué)者用乙醇水溶液粗提得到茶葉花青素的水溶液，用石油醚脫脂后用三氯乙烷萃取，得到氯仿層溶液和水層;水層用乙酸乙酯萃取得到花青素水溶液，濃縮后干燥得到粗提物。接著采用硅膠柱層析分離，用不同的溶劑進(jìn)行梯度洗脫，將斑點相似或相同的洗脫液合并，濃縮干燥，采用紫外－可見光譜掃描并進(jìn)行初步鑒定，在465～550nm有吸收峰，可以確定含有花青素。羅正飛等［26］采用乙醇溶劑提取紫鵑茶中的花青素物質(zhì)，研究了最佳提取工藝:70%乙醇溶劑、回流30min、回流溫度 80℃，料液比 1∶10［12］，本文采用文獻(xiàn)［27］的方法測定了花青素含量。

黑布林是花青素提取的一種材料來源。有學(xué)者采用正交實驗對黑布林皮中的花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了適宜的提取工藝條件為75%乙醇溶液、pH為2.5、浸提溫度50℃、浸提時間60min、料液比1∶5可得花青素最大提取率為0.539%。此外，還發(fā)現(xiàn)黑布林皮花青素可與常用的食品基質(zhì)配伍，對熱、酸及常見的金屬離子都有較好的穩(wěn)定性?；ㄇ嗨乜偭坎捎胮H示差法測定［15］。

對藍(lán)莓類材料中花青素提取的研究較多。有學(xué)者［19］采用乙醇浸提法提取藍(lán)莓果中的花青素。研究認(rèn)為最佳提取條件為 pH3.5、浸提溫度50℃、浸提60min、乙醇濃度50%，提取1次的提取率最高。還有研究人員比較了四種提取液對草莓和藍(lán)莓花青素提取的效果，發(fā)現(xiàn)甲醇—水—乙酸提取量最好，建議采用 HPLC 法對花 青 素進(jìn) 行 定 量［24］。Dai［28］采 用0.01%HCl/乙醇超聲處理黑莓湯，凍干后得到花青素提取物。篩選了不同酸性乙醇的濃度，分別為100%、90%、75%、50%、25%、10%。發(fā)現(xiàn)濃度為50%時的總提取含量最多?；ㄇ嗨氐目偭繙y定采用pH示差法;單體測定采用HPLC方法、在524nm下檢測主要花青素種類。

糧食作物中紫甘薯和紫玉米研究的較多。姚鈺蓉［29］的研究表明，通過單因素和正交實驗得到紫甘薯花青素最佳提取條件:甲酸濃度5%，提取溫度60℃，提取時間1h，料液比1∶10，提取3次。對紫玉米花青素提取的研究發(fā)現(xiàn)，以蒸餾水、酸性水溶液(pH3)和酸性醇為提取劑時，酸性醇的提取率明顯高于其他方法［30］。

還有對一些紫紅色花中花青素提取的研究，如李升鋒［31］運(yùn)用四因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計實驗方案，研究了溫度、時間、液料比、乙醇濃度對玫瑰茄干花萼花青素提取率的影響，確定了花青素提取的較好條件。國外的Ben Amor［32］利用熱化學(xué)快速降壓(DIC)使洛神葵花萼組織破碎，研究了各種操作參數(shù)，認(rèn)為DIC處理可以改善洛神葵花萼花青素的動力學(xué)和提取的產(chǎn)率。

3 花青素分析方法及組成鑒定方法

花青素的測定方法包括用單一pH法和pH示差法;組成及組分含量鑒定采用色譜法。

單一pH法:采用水溶液浸提茶湯，用酸性乙醇顯色，在535nm測定花色苷含量，一般用平均比消光度(101.83)來測定花色苷總量［27］。

pH示差法:在兩個不同的pH下，花青素溶液的吸光值的差值與花青素的含量成比例。即在520和700nm下測定pH1.0和pH4.5處理液吸光度值的差異。國內(nèi)外很多研究采用這種方法測定，認(rèn)為該法能很好地消除溶液中雜質(zhì)對測定結(jié)果的影響［10］。

陳瓊等［33］采用上述兩種方法比較測定了茶樹芽葉花色苷含量，結(jié)果表明:單一pH法測定值高于pH示差法，兩者線性關(guān)系良好;pH示差法能較好地消除干擾物質(zhì)對測定結(jié)果的影響，為茶葉的花色苷定量分析提供了依據(jù)。

色譜法是樣品組分分離鑒定的重要分離手段，并在多種物質(zhì)的鑒定方面已經(jīng)大規(guī)模應(yīng)用。Kerio等［10］采用 SPE方法純化 kenya茶花青素后，利用HPLC－UV－Vis在520nm測定了花青素組分，在發(fā)酵和未發(fā)酵茶葉中鑒定出天竺葵素、矢車菊素、飛燕草色素、芍藥素和錦葵色素。其中最主要的是錦葵色素。

Nafiz Oncu Can［34］等采用梯度洗脫利用 HPLCDAD在18min內(nèi)對28種水果和蔬菜中的花青素進(jìn)行了分離和鑒定，鑒定了6種食物中最多的花青素物質(zhì)，如三種葡萄糖苷的天竺葵色素、花青素、芍藥素、花翠素、牽?；ㄉ亍㈠\葵色素苷元。

反向逆流色譜(CCC)已經(jīng)成功地應(yīng)用到分離和純化花青素物質(zhì)，CCC分離所用的溶劑是極性的，因為含有n－丁醇，所以在濃縮和揮發(fā)時比較難把握。通常會使用三氟乙酸(TFA)防止花青素平衡向陽離子方向轉(zhuǎn)化，也會改善分離效果［35］。紫露草葉、紫棉、接骨木果汁、紅酒、黑莓中花青素也開展了CCC高速逆流色譜的分析，HPLC－ESI－MS得到了純的花青素［36］。Cato Fr?ytlo［37］利用 Toyopearl HW－40F gel和反相液相色譜法可以分離黑醋栗的花青素，而不需要使飛燕草素－3－O－葡萄糖苷和花青素－3－O－蕓香糖苷及小的芍藥素和錦葵色素－3－O－蕓香糖條帶重疊。

國內(nèi)學(xué)者利用高效液相色譜－電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC－ESI－MS/MS)對藍(lán)莓提取物中的花青素和黃酮醇進(jìn)行了分析，結(jié)構(gòu)上的不同導(dǎo)致花青素和黃酮醇在紫外－可見光譜吸收、離子化以及裂解方式上都存在差異［38］。花青素在530nm附近有特征吸收，負(fù)離子模式下黃酮醇可以生成負(fù)離子和自由基負(fù)離子，而正離子型的花青素則幾乎不產(chǎn)生質(zhì)譜信號，這一顯著差異可以區(qū)別花青素和黃酮醇。研究中鑒定了飛燕草定－3－O－葡萄糖苷，錦葵定－3－O－葡萄糖苷和槲皮素［38］。

4 結(jié)論和展望

4.1 花青素物質(zhì)的分離一般采用酸性醇溶液，利用超聲波輔助萃取、微波萃取、加熱萃取等方法進(jìn)行。提取條件包括酸的濃度(pH)、醇濃度、浸提時間、浸提溫度、料液比、提取次數(shù)等;在單因素實驗基礎(chǔ)上通過正交或者二次旋轉(zhuǎn)回歸方法對提取因素進(jìn)行優(yōu)化?？偭繙y定方法為單一pH法和pH示差法;組分測定采用HPLC方法。

4.2 花青素使花瓣和果實呈現(xiàn)出亮麗的顏色，還具有延緩衰老、抗腫瘤細(xì)胞發(fā)生、預(yù)防心腦血管疾病、降血糖等多種生理功能。開發(fā)天然色素具有較高的使用安全性和功能性，因此相信隨著社會的不斷進(jìn)步、科技的日益創(chuàng)新，在天然色素的開發(fā)領(lǐng)域花青素資源具有更加廣泛的發(fā)展空間和前景。

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