田來強(qiáng)，劉衛(wèi)東，陳曦，馮進(jìn)輝，楊洪江，吳洽慶，朱敦明，馬延和

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 3004572 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

一種來源于畢赤酵母的高對(duì)映選擇性羰基還原酶的性質(zhì)及底物譜分析

田來強(qiáng)1,2，劉衛(wèi)東2，陳曦2，馮進(jìn)輝2，楊洪江1，吳洽慶2，朱敦明2，馬延和2

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457
2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

田來強(qiáng), 劉衛(wèi)東, 陳曦, 等. 一種來源于畢赤酵母的高對(duì)映選擇性羰基還原酶的性質(zhì)及底物譜分析. 生物工程學(xué)報(bào),2013, 29(2): 169?179.

Tian LQ, Liu WD, Chen X, et al. Biochemical characterization and substrate profile of a highly enantioselective carbonyl reductase fromPichia pastoris. Chin J Biotech, 2013, 29(2): 169?179.

手性醇是一類非常重要的化合物，羰基還原酶催化酮的不對(duì)稱還原生成對(duì)應(yīng)的手性醇。從畢赤酵母Pichia pastorisGS115基因組數(shù)據(jù)中找到一個(gè)潛在的 NADPH依賴的羰基還原酶，研究畢赤酵母P. pastorisGS115中的羰基還原酶。根據(jù)其核酸序列設(shè)計(jì)引物，從P. pastorisGS115基因組中擴(kuò)增到目的基因ppcr，大腸桿菌BL21 (DE3) 中表達(dá)，Ni-NTA純化，對(duì)酶的性質(zhì)和底物譜進(jìn)行了研究。PPCR的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，最適反應(yīng)pH為6.0，低于45 ℃時(shí)有很好的穩(wěn)定性。對(duì)3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的Km和kcat分別為9.48 mmol/L和0.12 s-1。PPCR表現(xiàn)出廣泛的底物譜和很高的對(duì)映選擇性，對(duì)醛、α-酮酯、芳香族β-酮酯及芳香族酮都表現(xiàn)出了很好的活性，在測(cè)定的底物中，除極少數(shù)底物外，ee值均達(dá)到 97%以上。因此，PPCR具有較好的應(yīng)用前景。

羰基還原酶，不對(duì)稱還原，手性醇，畢赤酵母

2006年美國FDA批準(zhǔn)的小分子藥物中，80%是手性化合物，75%是手性化合物的單構(gòu)型立體異構(gòu)體[1]。手性醇是一類非常重要的化合物，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、液晶材料等方面廣泛應(yīng)用，可以通過有機(jī)合成和生物轉(zhuǎn)化兩種方式獲得，生物轉(zhuǎn)化法因其具有環(huán)境友好及高立體選擇性的特點(diǎn)而被人們認(rèn)可[2-4]，用生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)光學(xué)純的手性醇可以用酶催化法[5-10]或者全細(xì)胞催化法[11-14]進(jìn)行，羰基還原酶是生物轉(zhuǎn)化法中一類非常重要的酶。

羰基還原酶的分類有很多，按催化功能及一級(jí)結(jié)構(gòu)可以分為3大類：醛還原酶 (AKR)、短鏈脫氫酶 (SDR) 及鋅依賴的醇脫氫酶。其中SDR是非常龐大的酶家族，該家族中不同酶之間的氨基酸序列同源性較低，僅有幾個(gè)非常保守的氨基酸殘基，但它們都有N端的Rossmann折疊結(jié)構(gòu)、NAD/NADP-結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域以及 C端的催化區(qū)域[15-16]。Classical SDRs和 Extended SDRs是SDRs家族中最重要的兩個(gè)亞族，Classical SDRs家族的酶有共同的輔酶結(jié)合區(qū)域及結(jié)合序列：TGXXX[AG]XG (X代表任意的一種氨基酸)；它們亦有保守的催化序列：YXXXK。酪氨酸在催化過程中發(fā)揮著重要作用，是催化中心的關(guān)鍵氨基酸，而除了酪氨酸和催化序列中的賴氨酸外，催化序列上游經(jīng)常有絲氨酸和天冬酰胺對(duì)酶的催化起到輔助作用，C端通常在序列上變化較大，可能與酶的底物特異性密切相關(guān)[17-18]。

通過基因組數(shù)據(jù)庫挖掘，從P. pastorisGS115中找到一個(gè)潛在羰基還原酶基因ppcr，成功克隆并構(gòu)建到載體PET28a (+) 上，在大腸桿菌Escherichia coliBL21中表達(dá)，Ni-NTA純化，并對(duì) PPCR的酶學(xué)性質(zhì)和生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究。PPCR表現(xiàn)出廣泛的底物譜和很好的對(duì)映選擇性，對(duì)醛、α-酮酯、β-酮酯及芳香族的酮表現(xiàn)出了很高的活性和對(duì)映選擇性 (ee值)，是一種新的有應(yīng)用潛力的羰基還原酶。

1 材料與方法

1.1 材料

P. pastorisGS115為本實(shí)驗(yàn)室保存，pET28a (+)載體和E. coliBL21 (DE3) 購自Novagen公司；PCR相關(guān)酶購自TaKaRa (大連)公司；限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ以及 T4 DNA連接酶購自NEB公司；基因組提取、質(zhì)粒提取純化試劑盒購自Tiangen公司；Ni-NTA填料購自GE Health Care公司；BCA試劑盒購自CWBIO公司；考馬斯亮藍(lán) R250購自 Solarbio公司；實(shí)驗(yàn)中所使用的羰基化合物均來自 Alfa Aesar或Sigma Aldrich公司；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.2 PPCR的克隆與表達(dá)

用酵母基因組試劑盒提取P. pastorisGS115基因組：細(xì)胞用 200 μL 裂解液 (2%Triton X-100，1% SDS，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA)重懸，于-80 ℃冷凍20 min，95 ℃水浴1 min，重復(fù)上述過程3次，渦旋振蕩30 s，用試劑盒提取基因組。

以潛在羰基還原酶基因 (GenBank Accession No. XM_002491410) 為模板設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，正向引物：5'-CATGCCATGG GTACTG TCATTATTTTAACT-3'；反向引物：5'-CCG CTCGAG GGTTTGGTACTGTTCCAATA-3'，下劃線分別為NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以提取的酵母基因組為模板擴(kuò)增目的基因，PCR條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸15 min。PCR產(chǎn)物雙酶切 (NcoⅠ和XhoⅠ) 后構(gòu)建到pET28a (+) 上，轉(zhuǎn)化E. coliBL21 (DE3)，提取質(zhì)粒測(cè)序并雙酶切驗(yàn)證。成功表達(dá)的目的蛋白C端有6×His標(biāo)簽。培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl。培養(yǎng)時(shí)加入50 mg/L的卡那霉素，菌體在37 ℃、200 r/min生長至OD600為0.6～1.0時(shí)加入0.5 mmol/L的異丙基-β-D 硫代半乳糖苷 (Isopropyl-β-D-thiogal acto-pyranoside；IPTG)，20 ℃誘導(dǎo) 10 h，4 ℃、6 500 r/min離心15 min，收集菌體。

1.3 目的蛋白的純化

收集菌體用緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，5%甘油，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑) 重懸，4 ℃高壓勻漿破碎。12 000 r/min離心30 min，棄細(xì)胞碎片，上清用0.45 μm的濾膜過濾，Ni-NTA柱純化，先用A液洗滌，再用B液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，5%甘油，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑) 進(jìn)行0～250 mmol/L咪唑線性洗脫。所得純酶用Amicon Ultra-15超濾管 (截留分子量：10 kDa)濃縮，緩沖液C (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl) 脫鹽后，用于后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)和催化反應(yīng)。蛋白質(zhì)濃度用BCA試劑盒檢測(cè)，使用牛血清白蛋白BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

PPCR在溶液中的聚集狀態(tài)通過SDS-PAGE及分子篩 (Superdex 200 10/300 GL) 來確定。分子篩所用流動(dòng)相為20 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 7.2)，150 mmol/L NaCl。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為：Ovalbumin(43.0 kDa)，Conalbumin (75.0 kDa)，Conalbumin(158.0 kDa)，F(xiàn)erritin (440.0 kDa)，Thyroglobulin(669.0 kDa)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白與目的蛋白的保留體積計(jì)算PPCR的相對(duì)分子質(zhì)量。

PPCR活性測(cè)定：使用微板光譜儀連續(xù)監(jiān)測(cè)340 nm輔酶NADPH的降低 (ε=6 200 L/(mol·cm))來進(jìn)行。測(cè)活反應(yīng)總體積為200 μL，緩沖液為100 mmol/L的磷酸鈉緩沖液 (pH 6.0)，底物3-甲基-2-羰基丁酸乙酯終濃度為 6.5 mmol/L，NADPH終濃度為 0.25 mmol/L，PPCR終濃度0.005 g/L。一個(gè)酶活性單位定義為每分鐘消耗1 μmol NADPH所需要的酶量。

最適pH：測(cè)定純酶在不同pH緩沖液中的酶活來確定。所用緩沖液分別為：100 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液 (pH 4.0～6.0)，100 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液 (pH 6.0～8.0)，所用底物為3-甲基-2-羰基丁酸乙酯。

最適反應(yīng)溫度：測(cè)定底物 3-甲基-2-羰基丁酸乙酯在磷酸緩沖液 (100 mmol/L，pH 6.0)中不同溫度 (25 ℃～60 ℃)下的酶活來確定。酶熱穩(wěn)定性是將酶放在含有 100 mmol/L NaCl的Tris-HCl (20 mmol/L，pH 8.0) 緩沖液中，在不同溫度下分別孵育不同時(shí)間，然后檢測(cè)殘余酶活力。

動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax：在最適溫度、pH條件下，測(cè)定不同底物濃度時(shí)酶的活力。底物為3-甲基-2-羰基丁酸乙酯，輔酶 NADPH的終濃度為0.25 mmol/L，動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax通過非線性擬合方法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 底物譜測(cè)定

以不同類型的羰基化合物測(cè)定 PPCR活性，對(duì)有活性的底物均建立催化反應(yīng)體系以檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物構(gòu)型。反應(yīng)體系 (1 mL) 包含：100 mmol/L的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 6.0)，葡萄糖18 mg，NADP+0.5 mg，葡萄糖脫氫酶 2～3個(gè)酶活單位，0.02 mmol底物(1%的DMSO助溶)，PPCR (約2個(gè)活力單位)。30 ℃下200 r/min反應(yīng)24 h后，結(jié)束反應(yīng)。

加入相同體積的甲基叔丁基醚萃取，使用高效液相 (HPLC) 或氣相 (GC) 檢測(cè)產(chǎn)物的產(chǎn)率以及ee值。HPLC檢測(cè)中將萃取液在通風(fēng)櫥中晾干，用體積比為9∶1的異丙醇和正己烷溶解，用0.22 μm的濾膜過濾后，濾液用于HPLC分析，手性柱為IB、OD-H或AD-H。GC檢測(cè)中，萃取液用0.22 μm濾膜過濾后，進(jìn)行GC分析，手性柱為 Gamma DEXTM 225 Capillary Column (30 m × 0.25 mm × 0.25 mm，SUPELCO，Japan)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羰基還原酶PPCR序列比對(duì)

羰基還原酶 PPCR與其他幾個(gè)來自酵母的羰基還原酶比對(duì)結(jié)果如圖 1所示。PPCR與Classical SDRs家族的酶 (圖1中的PSCR、S1、KACR) 有共同的輔酶結(jié)合序列和催化序列，即位于N端的輔酶結(jié)合序列TGXXX[A/G]XG (圖中黑框標(biāo)出的第52～59位氨基酸) 及位于C端的催化序列YXXXK (圖中標(biāo)出的第208～212位氨基酸)。在催化序列的上游有兩個(gè)對(duì)催化起到輔助作用的氨基酸即：絲氨酸 (圖1 PPCR序列中黑框標(biāo)出的第 192位氨基酸) 和天冬酰胺(圖1 PPCR序列中黑框標(biāo)出的第155位氨基酸)。PPCR與來自畢赤酵母的 PSCR (GenBank Accession No. XP_001387287)[19]、木蘭假絲酵母的S1 (GenBank Accession No. BAB21578)[20]、克魯維酵母屬的KACR (GenBank Accession No.BAD01116)[21]和假絲酵母的 CPCR1 (GenBank Accession No. AFD29185)[22]的同源性分別是27%、31%、30%和37%。如圖1所示，CPCR1沒有Classical SDRs家族的酶的保守序列，因而不屬于同一亞族。PPCR與PSCR、S1及KACR相比，C端的同源性較低，可能具有較為獨(dú)特的底物譜。

2.2 羰基還原酶PPCR的克隆表達(dá)與純化

以P. pastorisGS115基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到與目的片段大小一致 (759 bp) 的基因，測(cè)序驗(yàn)證，目的基因電泳圖譜如圖2所示。構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET28a(+)-ppcr，在大腸桿菌BL21 (DE3) 中表達(dá)，Ni-NTA純化得到高純度目的蛋白。表達(dá)及純化圖譜見圖 3，純化參數(shù)如表1所示。

圖1 PPCR與其他酵母來源的還原酶序列比對(duì)結(jié)果Fig. 1 Sequence alignment of PPCR to other carbonyl reductase. Sequences PSCR from Pichia stipotis, S1 from Candida magnolia, KACR from Kluyveromyces aestuarii, CPCR1 from Candida parapsilosis, PPCR of this study from P. pastoris GS115.

圖2 PCR產(chǎn)物電泳Fig. 2 Analysis of the PCR product. 1: marker; 2:genomic DNA of P. pastoris GS115; 3: PCR product of PPCR.

表1 PPCR純化表Table 1 Purification of PPCR

圖3 蛋白表達(dá)純化圖譜Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expression and purification of PPCR. 1: supernatant of cell-free extract; 2: precipitation of cell-free extract; 3: Ni-NTA flow through; 4: purified PPCR; 5: low MW protein marker.

2.3 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

PPCR單體理論分子量為27.3 kDa，分子篩結(jié)果測(cè)得其分子量約為60 kDa，因此，PPCR聚集狀態(tài)為二聚體。

PPCR對(duì) NADPH有較高的偏好性，但對(duì)NADH也顯示出微弱活性。以 4-氯乙酰乙酸乙酯為底物時(shí)，其對(duì)NADPH以及NADH的比活分別為0.50 U/mg和0.05 U/mg。

以 3-甲基-2-羰基丁酸乙酯為底物進(jìn)行最適pH測(cè)定，結(jié)果如圖 4所示，從圖中可以看出PPCR的最適pH為6.0左右，磷酸緩沖液與來源于畢赤酵母的PSCR和假絲酵母的CPCR1相似，而來源于木蘭假絲酵母的羰基還原酶S1和克魯維酵母屬的KACR的最適pH較低，分別是5.5和5[19,21-23]。當(dāng)pH在7.5以上時(shí)，酶活驟然下降。在磷酸緩沖液里比其他的緩沖液酶活更高，說明PPCR更適合在磷酸緩沖液中反應(yīng)。

最適溫度研究結(jié)果表明：羰基還原酶PPCR在35 ℃下表現(xiàn)出了最高活性，而到60 ℃時(shí)基本沒有活性 (圖5)，可能在該溫度下大部分酶已失活。溫度穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果 (圖 6) 表明：35 ℃時(shí)PPCR有很好的穩(wěn)定性，45 ℃和55 ℃穩(wěn)定性下降，尤其55 ℃，穩(wěn)定性下降非常明顯。在45 ℃時(shí)PPCR的半衰期約40 min，而在55 ℃的半衰期只有9 min左右。

圖4 pH對(duì)酶活的影響Fig. 4 Effect of pH on enzyme activity. acetic acid /sodium acetate buffer (pH 4.0 to 6.0), sodium phosphate buffer (pH 6.0 to 8.0). The activity of enzyme at optimal buffer and pH (PB buffer, pH 6.0) was taken as 100%.

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響Fig. 5 Effect of temperature on enzyme activity. The activity of enzyme at optimal temperature (35 °C) was taken as 100%.

圖6 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig. 6 Effect of temperature on enzyme stability. The activity of enzyme without pre-incubation was taken as 100%.

2.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以 3-甲基-2-羰基丁酸乙酯為底物測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和kcat，測(cè)定條件如1.4所述，反應(yīng)在最適pH和最適溫度下進(jìn)行，PPCR對(duì)底物3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的Km為 9.48 mmol/L，kcat為 0.12 s-1。

2.5 底物譜測(cè)定

PPCR底物譜的測(cè)定結(jié)果表明，PPCR有廣泛的底物譜，包括醛類、α-酮酯、β-酮酯以及芳香族的酮等。測(cè)定結(jié)果如表2～5所示。

如表2所示，PPCR能還原對(duì)位取代的苯甲醛類底物，對(duì)位的取代基類型會(huì)影響到羰基還原酶PPCR對(duì)醛基還原的活性，它們的順序是F、Cl、NO2依次增強(qiáng)。

從表 3可以看出，PPCR對(duì) 3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的活性是 3-苯基-2-羰基丁酸乙酯活性的 6倍以上，引起這種現(xiàn)象的原因可能是苯環(huán)與甲基相比位阻比較大，對(duì)位阻較小的甲基容易反應(yīng)，而對(duì)位阻較大的苯環(huán)反應(yīng)比較困難。但 PPCR對(duì) α-酮酯都有較好活性，能夠非常有效地轉(zhuǎn)化 α-酮酯生成對(duì)應(yīng)的 (R)-a-羥基羧酸酯，而且產(chǎn)物構(gòu)型單一，ee都大于99%，說明PPCR對(duì)α-酮酯的對(duì)映選擇性很好，在α-酮酯類底物上有很好的應(yīng)用潛力。

表2 PPCR對(duì)醛的活性Table 2 Reduction of various aldehydes by PPCR

表3 PPCR對(duì)α-酮酯的活性Table 3 Reduction of α-ketoesters by PPCR

表4表明，PPCR對(duì)β-酮酯表現(xiàn)出較高的活性，并且有很高的立體選擇性，取代基 R基團(tuán)對(duì) PPCR催化 β-酮酯的活性有較大的影響，而對(duì)產(chǎn)物ee值的影響很小。從表中可以看出當(dāng)取代基 R為-CH2CH3時(shí)，活性明顯好于-CH3，說明底物碳鏈的長度會(huì)影響酶對(duì)底物的活力。當(dāng)取代基為-CH2Cl時(shí)，活力明顯好于-CH3，說明取代基上的Cl促進(jìn)了酶與底物的相互作用。對(duì)雙甲基取代的底物活性降低，可能是雙甲基的位阻比單甲基位阻大引起的。PPCR對(duì)β-酮酯還原產(chǎn)物ee均在99%以上，說明PPCR對(duì)β-酮酯類底物也有很好的應(yīng)用前景。

表4 PPCR對(duì)β-酮酯的活性Table 4 Reduction of β-ketoesters by PPCR

表5表明，羰基還原酶 PPCR可以催化很多芳香族酮的不對(duì)稱還原生成相應(yīng)的手性醇。a-位的取代基對(duì)酶的活性和立體選擇性都有較大的影響，如a位被溴或羥基取代時(shí)，產(chǎn)物的ee值明顯降低，而a-位是其他取代基時(shí)，催化活性相對(duì)較低。對(duì)于苯環(huán)取代的苯乙酮類底物，苯環(huán)上的取代基團(tuán)對(duì) PPCR的活性有一定的影響，而對(duì)產(chǎn)物的ee值的影響較小。

表5 PPCR對(duì)芳香族酮的活性Table 5 Reduction of various aryl ketones by PPCR

3 總 結(jié)

成功從P. pastorisGS115中克隆出一個(gè)新的羰基還原酶，在大腸桿菌中表達(dá)，Ni柱純化得到純酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。該酶以NADPH為輔酶，最適反應(yīng)溫度為35 ℃，最適反應(yīng)pH為6.0，在45 ℃以下有良好的穩(wěn)定性。該酶與一些已知的來源于酵母的羰基還原酶同源性較低 (30%左右)，使得它們可能具有不同的催化性能。PPCR對(duì)醛類、α-酮酯、β-酮酯及芳香族的酮都表現(xiàn)出較高的活性，催化 α-酮酯及β-酮酯還原的產(chǎn)物ee值都達(dá)到99%以上，對(duì)苯乙酮類化合物的還原，除a溴代或羥基取代的底物外，產(chǎn)物的ee值也大于97%。雖然文獻(xiàn)中對(duì)圖 1中這些已知的來源于酵母的羰基還原酶底物譜有所研究，但只對(duì)少數(shù)底物如 4-氯乙酰乙酸乙酯的還原反應(yīng)的立體選擇性進(jìn)行了報(bào)道。來源于克魯維酵母的KACR、木蘭假絲酵母的羰基還原酶S1和畢赤酵母的PSCR對(duì)β-酮酯和二酮類化合物表現(xiàn)出較好的催化活性，而對(duì)其他的酮如苯乙酮類底物，以及醛則沒有活性或者沒有報(bào)道[19-23]。與這些來源于酵母的 Classical SDRs家族的酶相比，PPCR具有一些獨(dú)特的性質(zhì)，如較廣的底物譜和優(yōu)良的立體選擇性，這有可能與PPCR的C端與PSCR、S1及KACR的同源性較低有關(guān)。因此，PPCR在生物催化手性醇的合成中具有較好的應(yīng)用前景。

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September 19, 2012; Accepted: November 30, 2012

Dunming Zhu. Tel: +86-22-84861962; Fax: +86-22-84861996; E-mail: zhu_dm@tib.cas.cn

中國科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重點(diǎn)方向項(xiàng)目 (No. KSCX2-EW-G-14), 國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB710801) 資助。

Biochemical characterization and substrate profile of a highly enantioselective carbonyl reductase fromPichia pastoris

Laiqiang Tian1,2, Weidong Liu2, Xi Chen2, Jinhui Feng2, Hongjiang Yang1,Qiaqing Wu2, Dunming Zhu2, and Yanhe Ma2

1College of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,China
2National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes,Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin300308,China

Carbonyl reductases catalyze carbonyl compounds to chiral alcohols that are important building blocks in fine chemical industry. To study carbonyl reductase fromPichia pastorisGS115 (ppcr), we discovered a new gene (ppcr)encoding an NADPH-dependent carbonyl reductase by genomic data mining. It was amplified by PCR from the genomic DNA, and expressed inEscherichia coliBL21 (DE3). The recombinant protein was purified to homogeneity. The optimum temperature was 37○C and the optimum pH of PPCR was 6.0. PPCR was stable below 45○C. TheKmandkcatvalue of the enzyme for ethyl 3-methyl-2-oxobutanoate were 9.48 mmol/L and 0.12 s-1, respectively. The enzyme had broad substrate specificity and high enantioselectivity. It catalyzed the reduction of aldehydes, α-ketoesters, β-ketoesters and aryl ketones to give the corresponding alcohols with >97%eewith only a few exceptions, showing its application potential in the synthesis of chiral alcohols.

carbonyl reductase, asymmetric reduction, chiral alcohol,Pichia pastoris

book=178,ebook=129

Supported by: Knowledge Innovation Project of Chinese Academy of Sciences (No. KSCX2-EW-G-14), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB710801).

Qiaqing Wu. Tel: +86-22-84861963; Fax: +86-22-84861996; E-mail: wu_qq@tib.cas.cn

(本文責(zé)編 陳宏宇)