王興春，楊致榮，張樹偉，李紅英,3，李生才

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 0308012 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西 太谷 0308013 農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 0300314 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801

擬南芥不定芽發(fā)生早期的數(shù)字基因表達(dá)譜分析

王興春1,2，楊致榮2，張樹偉1，李紅英2,3，李生才4

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801
2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西 太谷 030801
3 農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031
4 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801

王興春, 楊致榮, 張樹偉, 等. 擬南芥不定芽發(fā)生早期的數(shù)字基因表達(dá)譜分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(2): 189?202.

Wang XC, Yang ZR, Zhang SW, et al. Digital gene expression profiling analysis of the early adventitious shoot formation inArabidopsis thaliana. Chin J Biotech, 2013, 29(2): 189?202.

目前，有關(guān)不定芽發(fā)生的研究主要集中在單基因的調(diào)控方面，缺乏轉(zhuǎn)錄組方面的系統(tǒng)研究。利用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)了不定芽發(fā)生早期的基因表達(dá)譜，共檢測(cè)到2 457個(gè)差異表達(dá)基因。這些基因參與了激素代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、愈傷組織和側(cè)根的形成、莖頂端分生組織的發(fā)育和光合作用等過程。進(jìn)一步的途徑富集分析表明，不定芽發(fā)生早期苯丙氨酸代謝和苯丙胺素合成等途徑相關(guān)的基因顯著富集。并且苯丙氨酸可以顯著抑制不定芽的發(fā)生，暗示了苯丙氨酸代謝和苯丙胺素的合成可能在不定芽發(fā)生過程起著重要的作用。

擬南芥，離體器官發(fā)生，不定芽形成，轉(zhuǎn)錄組，數(shù)字基因表達(dá)譜

作為植物再生完整植株的最主要方式之一，不定芽發(fā)生不僅廣泛應(yīng)用于植物發(fā)育調(diào)控機(jī)制等基礎(chǔ)理論問題的研究，而且是植物快速繁殖和利用生物技術(shù)進(jìn)行作物遺傳改良的前提和基礎(chǔ)[1-2]。因此，深入研究不定芽發(fā)生的機(jī)制既具有重要的理論價(jià)值又有廣闊的應(yīng)用前景。

植物激素尤其是細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素是影響不定芽發(fā)生的關(guān)鍵因素，因此調(diào)控激素代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因通常也參與不定芽發(fā)生過程[3-6]。在無外源細(xì)胞分裂素的情況下，擬南芥功能獲得性突變體植物生長(zhǎng)激活子plant growth activator 22(pga22) 和細(xì)胞分裂素非依賴突變體cytokinin independent 1(cki1) 可以分化出大量不定芽[5]。PGA22基因編碼一個(gè)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，該酶催化細(xì)胞分裂素生物合成的一個(gè)限速步驟；而CKI1曾被認(rèn)為是細(xì)胞分裂素的受體，但由于在體外不能結(jié)合細(xì)胞分裂素，故該推測(cè)還有待進(jìn)一步證實(shí)。細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子 B型細(xì)胞分裂素響應(yīng)子 RESPONSE REGULATOR (ARR) 過量表達(dá)通常促進(jìn)不定芽的再生，而A型ARR通常會(huì)抑制不定芽的再生[6-7]。

在模式植物擬南芥中，不定芽形成主要通過兩步培養(yǎng)法進(jìn)行：首先，將擬南芥的根或下胚軸在含有高濃度 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D) 的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (Callus induction medium, CIM) 中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；然后，再轉(zhuǎn)移到含有高濃度細(xì)胞分裂素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (Shoot induction medium,SIM) 繼續(xù)培養(yǎng)，即可分化出不定芽[8]。深入探討上述步驟相關(guān)基因的表達(dá)及其關(guān)系，對(duì)于闡明不定芽發(fā)生的分子機(jī)制具有重要的意義。Che等[9-10]利用基因芯片技術(shù)分析了擬南芥愈傷組織、不定芽和不定根再生過程中基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了一系列在不同的發(fā)育過程中差異表達(dá)的基因。最近，Xu等[11]利用基因芯片技術(shù)研究了愈傷組織形成早期的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了一大批新的調(diào)控基因。其中轉(zhuǎn)錄因子HB52和CRF3的過量表達(dá)使外植體在無生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上產(chǎn)生愈傷組織。這些研究雖然在一定程度上揭示了植物離體器官發(fā)生的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但由于所用芯片的探針數(shù)量有限，且基因芯片檢測(cè)的靈敏度相對(duì)較低，不能對(duì)所有基因進(jìn)行檢測(cè)。與基因芯片相比，近年來發(fā)展起來的高通量測(cè)序技術(shù)有著諸多優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控等領(lǐng)域的研究[12]。但到目前為止，高通量測(cè)序技術(shù)仍未應(yīng)用于不定芽發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄組研究。為此，我們利用 RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)了在不定芽發(fā)生早期差異表達(dá)的基因，為揭示不定芽發(fā)生的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)基

本研究使用的野生型擬南芥Arabidopsis thaliana為Wassilewskija (WS) 生態(tài)型。

萌發(fā)培養(yǎng)基：1/2×MS (PhytoTechnology Laboratories，貨號(hào)M519)、20 g/L蔗糖和8 g/L瓊脂粉，pH 5.8。

CIM 培養(yǎng)基：1×MS (PhytoTechnology Laboratories，貨號(hào)M519)，10 g/L蔗糖，0.5 g/L MES，100 mg/L 肌醇，10 mg/L VB1, 1 mg/L VB3，1 mg/L VB6，0.5 mg/L 2,4-D，0.05 mg/L 激動(dòng)素(Kinetin，KT)，和2.5 g/L植物凝膠，pH 5.8。

SIM培養(yǎng)基：與CIM成分相似，只是將CIM中的2,4-D和KT替換為 0.2 mg/L吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA) 和0.5 mg/L反式玉米素 (trans-zeatin)。

1.2 方法

1.2.1 愈傷誘導(dǎo)和不定芽發(fā)生

擬南芥種子消毒后成簇播種在萌發(fā)培養(yǎng)基上，注意不能太分散，以便后期取材。4 ℃避光春化2～3 d后，置于溫室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為22 ℃，16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為20～30 μmol/(m2·s)的弱光，以利于下胚軸的伸長(zhǎng)。7 d后，取下胚軸放在富含生長(zhǎng)素的CIM上培養(yǎng)7 d；然后再轉(zhuǎn)移到SIM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 總RNA的提取和RNA-Seq

分別取CIM培養(yǎng)7 d (CIM7) 和SIM培養(yǎng)2 d(SIM2) 的材料提取總RNA。100 mg植物材料在液氮中研磨成粉末，然后利用康為世紀(jì)生物科技有限公司的RNA提取試劑盒 (含有DNase I，貨號(hào)CW0559) 提取總RNA。總RNA利用Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)檢測(cè)合格后，利用帶有Oligo (dT) 的磁珠富集mRNA。富集的mRNAs隨機(jī)打斷成 200 nt的片段，再以片段化后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈；加入緩沖液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I合成cDNA第二鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加 EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。建好的文庫用Illumina HiSeq? 2000進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)量的計(jì)算使用 RPKM 法 (Reads Per Kb per Million reads)[13]，該方法能消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序深度差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，因此計(jì)算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異。差異表達(dá)基因?yàn)?False Discovery Rate (FDR) ≤0.001且差異倍數(shù)不低于2倍 (即log2的絕對(duì)值≥1) 的基因。

Gene Ontology (GO) 功能顯著性富集分析采用 Gene Ontology數(shù)據(jù)庫 (http://www.geneontology.org/) 進(jìn)行，將差異表達(dá)的基因向gene ontology數(shù)據(jù)庫的各term映射。計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)目。P≤0.05為顯著富集的 GO term。途徑顯著性富集分析 (Pathway enrichment analysis) 采用 KEGG數(shù)據(jù)庫[14]進(jìn)行，將差異表達(dá)基因向KEGG數(shù)據(jù)庫映射，并統(tǒng)計(jì)基因在每個(gè)途徑中的富集程度 (Pvalue)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-Seq高通量測(cè)序和評(píng)估

擬南芥下胚軸在富含生長(zhǎng)素的 CIM 培養(yǎng)基培養(yǎng) 7 d后 (CIM7)，中柱鞘部位膨大，形成大量愈傷組織 (圖 1A)。將其轉(zhuǎn)移到富含細(xì)胞分裂素的SIM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d (SIM2)，愈傷組織繼續(xù)膨大，顏色由白色變成淡黃色 (圖 1B)。分別提取CIM7和SIM2的總RNA，構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)行 RNA-Seq實(shí)驗(yàn)。CIM7和 SIM2樣品RNA-Seq測(cè)序分別得到11 001 875和1 054 546 raw reads，其中clean reads分別為10 956 306和 10 956 306，分別占 raw reads的 99.55%和99.59%。去除雜質(zhì)后的clean reads用作后續(xù)分析。

圖1 RNA-Seq用外植體CIM7和SIM2Fig. 1 Explants of CIM7 and SIM2 for RNA-Seq. (A)Callus formation in CIM7. (B) Callus formation in SIM2.

我們使用短 reads比對(duì)軟件 SOAPaligner/soap2[15]將得到的 clean reads分別比對(duì)到擬南芥參考基因序列 (ftp://ftp.arabidopsis.org/Sequences/blast_datasets/TAIR10_blastsets/TAIR10_cdna_20 101214)。結(jié)果表明，樣品CIM7和SIM2得到的clean reads中，分別有92.96%和93.13%的clean reads匹配到擬南芥的2 3878個(gè)參考基因上 (表1和表2)。每個(gè)基因平均被426.52 (CIM7)和393.64(SIM2)個(gè)clean reads覆蓋。

表1 樣品CIM7和擬南芥參考基因比對(duì)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Alignment statistics of CIM7 to Arabidopsis reference genes

表2 樣品SIM2和擬南芥參考基因比對(duì)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Alignment statistics of SIM2 to Arabidopsis reference genes

測(cè)序飽和度分析表明，當(dāng)clean reads在2 M以下時(shí)，檢測(cè)到的基因數(shù)與測(cè)序量成正比；當(dāng)達(dá)到2 M以上時(shí)，趨于平緩；超過8 M時(shí)檢測(cè)到的基因數(shù)已經(jīng)接近飽和 (圖2A和2B)。樣品CIM7和SIM2的測(cè)序量分別為10.18 M和9.40 M，已經(jīng)接近飽和。隨后，我們又對(duì)測(cè)序的隨機(jī)性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明樣品 CIM7和 SIM2的 reads在參考基因上基本成隨機(jī)分布 (圖 2C和 2D)。上述結(jié)果表明本次測(cè)序結(jié)果能夠較好地反應(yīng)細(xì)胞中基因表達(dá)的真實(shí)情況，可以用于后續(xù)基因差異表達(dá)分析。

圖2 測(cè)序飽和度和隨機(jī)性評(píng)估Fig. 2 Sequencing saturation and randomness assessment. (A,B) Sequencing saturation analysis of CIM7 (A) and SIM2 (B). (C,D) Sequencing randomness analysis of CIM7 (C) and SIM2 (D).

2.2 不定芽發(fā)生早期差異表達(dá)的基因

在不定芽發(fā)生早期，我們共檢測(cè)到2 457個(gè)差異表達(dá)基因，約占擬南芥整個(gè)基因組的10%左右。其中，有1 761個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，696個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)。這些基因參與了植物激素的平衡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、愈傷組織的形成、側(cè)根的發(fā)育、光合作用和細(xì)胞周期等。

2.2.1 激素平衡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與不定芽發(fā)生

在不定芽發(fā)生過程中，很多與細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素合成、代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因的表達(dá)量發(fā)生了顯著改變。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶 (Isopentenyl transferase，IPT) 是細(xì)胞分裂素合成的關(guān)鍵酶，催化細(xì)胞分裂素合成的一個(gè)限速步驟。在擬南芥中過量表達(dá)IPT基因?qū)е轮参矬w內(nèi)細(xì)胞分裂素含量上升，并促進(jìn)了不定芽的再生[5,16]。然而，我們發(fā)現(xiàn)在不定芽發(fā)生早期IPT5基因的表達(dá)量下降了近1 500倍 (表3)，而其他IPT基因的表達(dá)量沒有顯著變化，這暗示了IPT5基因可能在離體器官再生過程起著特殊的功能。作為細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑的下游組分，ARR是執(zhí)行細(xì)胞分裂素生理功能的效應(yīng)元件。在不定芽發(fā)生早期，有6個(gè)ARR基因的表達(dá)量顯著升高 (表3)。這6個(gè)ARR全部為A型ARR，而B型ARR的表達(dá)量卻沒有明顯變化。這與A型ARR基因的表達(dá)能被細(xì)胞分裂素快速誘導(dǎo)是相符的[16]。

外植體從含有高濃度生長(zhǎng)素的 CIM 中轉(zhuǎn)到含有低濃度生長(zhǎng)素的SIM培養(yǎng)基中后，一些參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因如IAA、GH3、SAUR和ARF等的表達(dá)量也發(fā)生了變化 (表3)。在擬南芥29個(gè)Aux/IAA中，有4個(gè)Aux/IAA基因 (IAA3、IAA17、IAA18和IAA28) 的表達(dá)量發(fā)生了上調(diào)；4個(gè)Aux/IAA基因 (IAA14、IAA19、IAA20和IAA30) 的表達(dá)量發(fā)生了下調(diào)。

有趣的是，雖然CIM和SIM都不含有乙烯、赤霉素和油菜素內(nèi)酯等其他激素，但有些與這些激素平衡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化 (表 3)。乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ETHYLENE-RESPONSIVE ELEMENT BINDING FACTOR，ERF) 是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，在植物脅迫反應(yīng)中起著重要的作用[17]。在擬南芥不定芽發(fā)生早期，有3個(gè)ERF基因的表達(dá)量發(fā)生顯著上升，其中ERF13的表達(dá)量上升了21.21倍。這些結(jié)果暗示了乙烯等其他激素也可能在不定芽發(fā)生過程起著間接的調(diào)控作用。

2.2.2 愈傷形成和側(cè)根發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

在不定芽發(fā)生早期，有 4個(gè) LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN (LBD) 家族的基因 (LBD16、LBD18、LBD19和LBD29) 的表達(dá)量顯著降低。其中LBD29基因的表達(dá)量降低幅度最大，達(dá)1 445.81倍，在不定芽發(fā)生早期完全關(guān)閉 (表3)。這4個(gè)LBD基因中，有3個(gè)(LBD16、LBD18和LBD29) 可以被CIM快速誘導(dǎo)，且它們中的任何一個(gè)異位表達(dá)都可以使外植體在無激素的情況下形成愈傷組織[18]。這表明，細(xì)胞由脫分化向再分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)，一些參與脫分化的基因?qū)⒁魂P(guān)閉。另外，由于愈傷組織和側(cè)根起源相同[19]，所以一些參與側(cè)根形成或發(fā)育基因的表達(dá)量也有所改變 (表3)。

2.2.3 莖頂端分生組織相關(guān)基因的表達(dá)

外植體在SIM培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d時(shí)，雖然還未出現(xiàn)明顯的莖頂端分生組織 (SHOOT APICAL MERISTEM，SAM) (圖1)，但SAM相關(guān)基因的表達(dá)已經(jīng)發(fā)生了變化 (表 3)。其中，CLAVATA3/ESR-RELATED 2(CLE2) 基因表達(dá)

上升幅度最大，上升了近 9 000倍。其次是CUP-SHAPED COTYLEDON 1(CUC1) 和CUC2基因，表達(dá)量分別提高了8.92倍和5.07倍。

表3 不定芽發(fā)生早期差異表達(dá)的基因Table 3 Differential expressed genes at the early stage of adventitious shoot formation

續(xù)表3

除了上述基因外，一些與細(xì)胞分化和細(xì)胞周期相關(guān)的基因的表達(dá)量也發(fā)生了顯著變化 (數(shù)據(jù)未顯示)。

2.3 不定芽發(fā)生早期代謝的變化

為了對(duì)差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能有更清晰的了解，我們進(jìn)行了途徑富集分析。結(jié)果表明，差異表達(dá)的2 457個(gè)基因中有1 364個(gè)基因可以映射到111個(gè)不同的生物途徑，顯著富集的途徑(Qvalue≤0.05) 有25個(gè) (表4)。其中，苯丙胺素合成和苯丙氨酸代謝相關(guān)途徑的基因顯著富集，分別富集了3.38倍和3.84倍。為了進(jìn)一步研究苯丙氨酸在不定芽發(fā)生過程的功能，我們將脫分化的下胚軸外植體放在含有不同濃度的苯丙氨酸的CIM培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果表明，1 mmol/L的苯丙氨酸即可以完全抑制不定芽的再生(圖 3)，暗示了苯丙氨酸和苯丙胺素的生物合成可能在不定芽發(fā)生過程中起著重要的作用。

除了苯丙胺素和苯丙氨酸途徑外，次生物質(zhì)合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和光合作用等相關(guān)途徑的基因也顯著富集了。進(jìn)一步的分析表明，差異表達(dá)的基因中光合途徑 (Photosynthesis pathway)、黃酮和黃酮醇生物合成途徑 (Flavone and flavonol biosynthesis) 的基因的表達(dá)量全部升高了，暗示了不定芽發(fā)生早期外植體開始由異養(yǎng)向自養(yǎng)轉(zhuǎn)變。而其余 23個(gè)途徑中既有上調(diào)基因又有下調(diào)基因，表明不定芽發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。

2.4 不定芽發(fā)生早期葉綠體相關(guān)組分顯著富集

GO 功能顯著性細(xì)胞組分 (Cellular component) 分析表明，在差異表達(dá)的2 457個(gè)基因中有 1 365個(gè)基因可以映射到 101個(gè)不同的term。其中富集的有20個(gè)term (表5)。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，富集 term中有一半以上 (11個(gè))term位于葉綠體/質(zhì)體中 (表5)，這暗示了在不定芽出現(xiàn)之前，外植體已經(jīng)具備了部分光合作用的能力。

圖3 苯丙氨酸抑制不定芽發(fā)生Fig. 3 Adventitious shoot formation was suppressed by phenylalanine. Hypocotyl explants were pre-cultured on CIM for 7 days and then cultured on SIM containing different concentration of phenylalanine for 12 days. (A)0 mmmol/L. (B) 0.1 mmol/L. (C) 1 mmol/L. (D)10 mmol/L. Bar= 1 cm.

表4 不定芽發(fā)生早期顯著富集的途徑Table 4 Pathways significantly enriched at the early stage of adventitious shoot formation

表5 不定芽發(fā)生早期差異表達(dá)基因的GO富集分析Table 5 GO analysis of the differential expressed genes at the early stage of adventitious shoot formation

3 討論

植物不定芽發(fā)生是一個(gè)眾多基因參與的復(fù)雜過程，在這一過程中許多基因的表達(dá)量發(fā)生了改變。Che等[9?10]曾利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了不定芽發(fā)生時(shí)基因的表達(dá)情況。但由于基因芯片技術(shù)本身的局限性，檢測(cè)的基因數(shù)目有限。另外，Che等用的是在SIM培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d的材料，此時(shí)外植體已呈淺綠色，葉綠體已經(jīng)開始分化。而我們利用的是在SIM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d的材料，更有利于早期差異表達(dá)基因的研究。Che等[9?10]利用基因芯片進(jìn)行的研究中，發(fā)現(xiàn)ARR5和RAP2.6L等基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。我們RNA-Seq技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，這兩個(gè)基因分別上調(diào)了2.96和2.25倍。此外，本研究表明ARR15、CUC1、CUC2和LBD29等基因的表達(dá)量也明顯上調(diào) (表3)，這些基因已經(jīng)被證明與不定芽發(fā)生有關(guān)。這些結(jié)果從側(cè)面證明本研究的 RNA-Seq檢測(cè)結(jié)果是可信的。除了這些已知基因外，我們也新發(fā)現(xiàn)了一大批以前在不定芽發(fā)生過程未研究過的基因 (如IPT5、CLE2、ERF13和GH3家族的基因等)，深入研究這些基因的功能將有助于我們對(duì)不定芽發(fā)生過程有更清晰的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸和苯丙胺素的合成與代謝可能在不定芽發(fā)生過程起著極其重要的作用。

細(xì)胞分裂素是影響不定芽發(fā)生的關(guān)鍵因子，也是SIM培養(yǎng)基中添加的主要外源激素。當(dāng)將外植體從富含生長(zhǎng)素的 CIM 培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到富含細(xì)胞分裂素的SIM培養(yǎng)基后，IPT5基因的表達(dá)量大幅下降，培養(yǎng)2 d時(shí)已經(jīng)檢測(cè)不到該基因的表達(dá)，而其他8個(gè)IPT基因的表達(dá)卻沒有明顯變化(表 3)。細(xì)胞分裂素在 4 h內(nèi)即可負(fù)反饋抑制IPT1、IPT3、IPT5和IPT7基因的表達(dá)[20]。因此，我們推測(cè)不定芽分化早期IPT5基因的表達(dá)量下降可能是由于 SIM 培養(yǎng)基上高濃度細(xì)胞分裂素負(fù)反饋調(diào)節(jié)的結(jié)果。但我們不排除IPT5基因在脫分化時(shí)起著重要作用的可能性，因此在脫分化時(shí)高表達(dá)，在再分化時(shí)表達(dá)量降低。為此，我們將深入研究IPT5基因在外植體脫分化階段的功能。除了IPT基因外，細(xì)胞分裂素的氧化分解是調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素含量動(dòng)態(tài)平衡的一種重要方式。這一反應(yīng)受到細(xì)胞分裂素氧化酶 (Cytokinin oxidase/dehydrogenase，CKX) 的催化。在不定芽發(fā)生早期，CKX7基因的表達(dá)量略有上升 (表3)，這可能是由于 SIM 中高濃度的細(xì)胞分裂素負(fù)反饋調(diào)控的結(jié)果。A型ARRs是細(xì)胞分裂素途徑的負(fù)調(diào)控因子，其中ARR15基因的表達(dá)可以被細(xì)胞分裂素快速誘導(dǎo)，且該基因可以作為細(xì)胞獲得全能性具備不定芽分化能力的標(biāo)記基因[21?22]。與該報(bào)道相一致，本實(shí)驗(yàn)表明在 SIM 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d時(shí)，ARR15的表達(dá)量提高了16.90倍。除了ARR15基因外，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ARR3、ARR5、ARR6、ARR7和ARR8等5個(gè)其他的A型ARR基因的表達(dá)量也都有所升高。除了上述細(xì)胞分裂素相關(guān)的基因外，生長(zhǎng)素相關(guān)的一些基因的表達(dá)量也發(fā)生了顯著變化 (表3)。生長(zhǎng)素調(diào)控著愈傷的形成，在細(xì)胞脫分化過程起著關(guān)鍵的作用。最近的一項(xiàng)研究表明，LBD16、LBD17、LBD18和LBD29等4個(gè)LBD基因位于生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF的下游，調(diào)控著愈傷組織的形成[18]。我們發(fā)現(xiàn)這些基因在不定芽形成早期表達(dá)量都有所下降，其中LBD29基因的表達(dá)量降幅最大為14 415.81倍 (表3)。這表明，這些基因雖然在愈傷組織形成過程起著重要作用，但在不定芽發(fā)生早期卻不再發(fā)揮功能。

SAM 的發(fā)育和分生能力的維持與不定芽的再生關(guān)系密切，許多SAM發(fā)育相關(guān)的基因突變也會(huì)影響不定芽的再生[2,23]。不定芽發(fā)生早期有9個(gè)和 SAM相關(guān)的基因的表達(dá)量發(fā)生了改變，其中上調(diào)的有6個(gè)，下調(diào)的3個(gè)。上調(diào)幅度較大的3個(gè)基因分別為CLE2、CUC1和CUC2。有關(guān)CUC1和CUC2基因在不定芽發(fā)生過程的功能已有報(bào)道[24]，但CLE2基因在不定芽發(fā)生過程的功能還不清楚。這些結(jié)果表明，雖然在SIM培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d時(shí)，還未出現(xiàn)不定芽，但此時(shí)一些芽頂端分生組織相關(guān)的基因已經(jīng)開始表達(dá)。

途徑富集分析表明，不定芽發(fā)生早期苯丙氨酸代謝和苯丙胺素合成的基因顯著富集 (表4)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，苯丙氨酸可以抑制不定芽的形成 (圖3)。苯丙胺素是一類由苯丙氨酸合成的重要的次生代謝物質(zhì)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程起著極其重要的作用[25]。但苯丙氨酸和苯丙胺素在不定芽發(fā)生過程的功能還不清楚，深入研究二者合成和代謝相關(guān)突變體不定芽的再生情況將有助于這一問題的解決。

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September 17, 2012; Accepted: November 6, 2012

Xingchun Wang. Tel: +86-354-6287191-306; Fax: +86-354-6289318; E-mail: wxingchun@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31100235, 31171181)，山西省青年科技研究基金 (No. 2010021030-1)，中國(guó)博士后研究經(jīng)費(fèi) (No. 80839) 資助。

Digital gene expression profiling analysis of the early adventitious shoot formation inArabidopsis thaliana

Xingchun Wang1,2, Zhirong Yang2, Shuwei Zhang1, Hongying Li2,3, and Shengcai Li4

1College of Life Sciences,Shanxi Agricultural University,Taigu030801,Shanxi,China
2Institute of Agricultural Bioengineering,Shanxi Agricultural University,Taigu030801,Shanxi,China
3Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau,Ministry of Agriculture,Taiyuan030031,Shanxi,China
4College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu030801,Shanxi,China

Most current research in the field of adventitious shoot formation is focused on the regulatory function of a single gene. However, a systematic transcriptomic analysis of the early adventitious shoot formation is still lacking. Here,we analyzed the transcriptome profiling of the early adventitious shoot formation inArabidopsisby RNA-seq high throughput sequencing technology, and identified 2 457 differentially expressed genes. Detailed categorization revealed that these genes were mainly involved in hormone homeostasis or signal transduction, callus and lateral root formation,shoot apical meristem development and photosynthesis. Further pathway enrichment analysis showed that genes involved in phenylalanine metabolism and phenylpropanoid biosynthesis were significantly enriched. Moreover, exogenous phenylalanine could repress adventitious shoot formation, indicating that phenylalanine metabolism and phenylpropanoid biosynthesis might be important for adventitious shoot formation.

Arabidopsis thaliana,in vitroorganogenesis, adventitious shoot formation, transcriptome, digital gene expression profiling

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31100235, 31171181), Natural Science Foundation of Shanxi Province(No. 2010021030-1), Postdoctoral Research Foundation (No. 80839).

Shengcai Li. Tel/Fax: +86-354-6288324; E-mail: sxaulisc@126.com

(本文責(zé)編 郝麗芳)