李浩，任嘉紅，葉建仁

南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037

響應(yīng)面法優(yōu)化生防菌吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007的發(fā)酵工藝

李浩，任嘉紅，葉建仁

南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037

李浩, 任嘉紅, 葉建仁. 響應(yīng)面法優(yōu)化生防菌吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007的發(fā)酵工藝. 生物工程學(xué)報, 2013, 29(2):243?246.

Li H, Ren JH, Ye JR. Optimization of biocontrol agentBurkholderia pyrrociniastrain JK-SH007 fermentation by response surface methodology. Chin J Biotech, 2013, 29(2): 243?246.

以吡咯伯克霍爾德氏菌Burkholderia pyrrociniaJK-SH007為出發(fā)菌株，對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，以期提高發(fā)酵效率。通過篩選試驗、最陡爬坡試驗和響應(yīng)面分析確定影響JK-SH007菌株生長最重要兩因素為玉米漿和葡萄糖，其最佳濃度分別為13.88 g/L和3.37 g/L。優(yōu)化后的發(fā)酵工藝培養(yǎng)該菌濃度可達(dá)1.18×109CFU/mL，比優(yōu)化前提高1.35倍，抑菌活性提高28.84%。

吡咯伯克霍爾德氏菌，發(fā)酵，響應(yīng)面法，玉米漿，生防菌

洋蔥伯克霍爾德氏菌群 (Burkholderia cepaciacomplex，簡稱 BCC) 是常見的生防菌，具有生物防治、生物降解及促進植物生長等多種功能[1-5]。本文研究的 JK-SH007菌株隸屬 genomovar Ⅸ：B. pyrrocinia，前期研究顯示其對楊樹潰瘍病具防治作用，且對楊樹具顯著的促生長作用[6-7]。為提高其生防效益，擴大應(yīng)用范圍，本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵工藝，以得到大量菌體，進行菌體制劑生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

吡咯伯克霍爾德氏菌Burkholderia pyrrociniaJK-SH007，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：M 209028；金黃殼囊孢菌Cytospora chrysosperma，楊樹潰瘍病原真菌，用于檢測JK-SH007發(fā)酵液抑菌活性，本實驗室分離保存[8]。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

初始發(fā)酵工藝參考文獻(xiàn)[7]，選取7種常用營養(yǎng)元素作為優(yōu)化發(fā)酵工藝的對象 (表1)。

1.3 菌體濃度測量及抑菌活性測定

發(fā)酵后測量各發(fā)酵液吸光值OD600，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)的菌體個數(shù)：y=(1.61x+0.11)108(式中：y為菌體個數(shù)/mL，x為吸光值)。發(fā)酵液抑菌活性測定參考文獻(xiàn)[7]。

1.4 數(shù)理統(tǒng)計方法

首先采用二水平正交試驗篩選主因素，然后采用最陡爬坡試驗逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后采用響應(yīng)面法對主因素的濃度進一步研究，以獲得最優(yōu)發(fā)酵工藝。

1.5 模型驗證

對最終所得的發(fā)酵工藝進行驗證，測定菌體濃度和發(fā)酵液抑菌活性，若菌體濃度與模型相符且抑菌活性無損失，便可以確定楊樹潰瘍病拮抗細(xì)菌JK-SH007的最佳發(fā)酵工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選試驗

各因素水平及方差分析見表1，試驗設(shè)置見表2?？梢娪衩诐{ (P＜0.01) 和葡萄糖 (P＜0.01) 對響應(yīng)影響極顯著。故選取此二者進行最陡爬坡試驗。麩皮和黃豆粉對響應(yīng)影響很小，不再添加；其他變量維持低水平。

2.2 最陡爬坡試驗

試驗設(shè)置及結(jié)果見表3，可見處理2的響應(yīng)值最大，故以其作為響應(yīng)面試驗的中心點，步長不變，進行下步試驗。

表1 各種因素的影響Table 1 Effects of different factors

表2 正交試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 2 Orthogonal design and responding value

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 3 Experimental design of steepest ascent and responding value

2.3 響應(yīng)面試驗

試驗設(shè)置及結(jié)果見表4，經(jīng)擬合得完全二次回歸 方 程 ：Y=7.10+0.34A+0.33B?0.34A2?0.71B2?0.16AB(式中：Y為響應(yīng)；A，B分別為玉米漿和葡萄糖濃度，單位g/L)。表5可見回歸模型的P值為0.00，擬合效果極顯著。計算可得當(dāng)玉米漿13.88 g/L、葡萄糖3.37 g/L時響應(yīng)值最大為7.21，見圖1。

2.4 模型驗證

圖1 菌體濃度的等值線圖和響應(yīng)曲面圖Fig. 1 Contour diagram and response surface plot of cell density.

表4 中心組合試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 4 Central composite design and responding value

表5 回歸分析結(jié)果Table 5 Results of regression analysis

分別采用初始和優(yōu)化后發(fā)酵工藝發(fā)酵，24 h后測量吸光值和抑菌活性，試驗重復(fù)4次。結(jié)果優(yōu)化后響應(yīng)值為7.25±0.37，與模型擬合較好。菌體濃度分別為 1.18×109CFU/mL 和 5.02×108CFU/mL，提高了1.35倍；抑菌活性分別為36.95%和28.68%，提高了28.84%。

3 結(jié)論

響應(yīng)面法是優(yōu)化因素配比的有效方法，得到廣泛的應(yīng)用[9-12]。本文通過此方法優(yōu)化得到生防菌JK-SH007的發(fā)酵工藝為：玉米漿13.88 g/L，葡萄糖 3.37 g/L，NaCl 1.00 g/L，KH2PO40.50 g/L，1/2裝液量，pH值7.00，接種量2%，30 ℃，200 r/min，培養(yǎng)24 h。優(yōu)化后菌體濃度提高了1.35倍，抑菌活性提高了 28.84%。玉米漿是制造玉米淀粉的副產(chǎn)品，葡萄糖可由淀粉水解得到，均廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)[13-16]，價格較低，而前期研究最佳主成分為牛肉膏和蛋白胨，價格高昂，本研究結(jié)果提高發(fā)酵效率的同時降低了培養(yǎng)基成本，為大量獲得JK-SH007生防菌劑奠定了基礎(chǔ)。

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October 22, 2012; Accepted: December 6, 2012

Jianren Ye. Tel: +86-25-85427305; E-mail: jrye@njfu.edu.cn

Optimization of biocontrol agentBurkholderia pyrrociniastrain JK-SH007 fermentation by response surface methodology

Hao Li, Jiahong Ren, and Jianren Ye
College of Forest Resources and Environment,Nanjing Forestry University,Nanjing210037,Jiangsu,China

In order to improve ferment efficiency of biocontrol agentBurkholderia pyrrociniaJK-SH007, the fermentation conditions of this strain were optimized. The optimal fermentation conditions were corn steep liquor(13.88 g/L) and glucose (3.37 g/L) by screening test, steepest ascent experiments and response surface analysis. The results showed that the cell density of JK-SH007 (1.18×109CFU/mL) increased 1.35 times than before, and there was a 28.84%increase in antifungal activity.

Burkholderia pyrrocinia, fermentation, response surface methodology, corn steep liquor, biocontrol agent

Supported by: China Postdoctoral Science Foundation (No. 20110491434), Chinese Special Fund Project for the Scientific Research of the Forest Public Welfare Industry (No. 201304404), the Innovation Plan for Graduate Students of Jiangsu Province (No. CXZZ11_0505).

國家博士后基金 (No. 20110491434)，國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項項目 (No. 201304404)，江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃 (No.CXZZ11_0505) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)