張璞，王芳，朱查山

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052

真菌誘導(dǎo)子與吸附樹脂對新疆紫草毛狀根中萘醌積累的影響

張璞，王芳，朱查山

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052

張璞, 王芳, 朱查山. 真菌誘導(dǎo)子與吸附樹脂對新疆紫草毛狀根中萘醌積累的影響. 生物工程學(xué)報, 2013, 29(2): 214?223.

Zhang P, Wang F, Zhu CS. Influence of fungal elicitor and macroporous resin on shikonin accumulation in hairy roots ofArnebia euchroma(Royle) Johnst. Chin J Biotech, 2013, 29(2): 214?223.

通過考察真菌誘導(dǎo)子與吸附樹脂對新疆紫草毛狀根中萘醌積累的影響，獲得真菌誘導(dǎo)子與吸附樹脂對萘醌類物質(zhì)積累的最佳處理，為規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。以新疆紫草毛狀根為試驗材料，將黑曲霉、米曲霉誘導(dǎo)子及其混合誘導(dǎo)子、大孔吸附樹脂添加到 M-9培養(yǎng)基中，采用分光光度法測定毛狀根總萘醌含量。試驗結(jié)果表明：在毛狀根培養(yǎng)10 d時以2.5∶50的比例添加混合誘導(dǎo)子，總萘醌含量是對照的2.28倍；在此結(jié)果基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)第0天添加大孔吸附樹脂NKA-9，總萘醌含量最高是對照的3.71倍；黑曲霉誘導(dǎo)子與米曲霉誘導(dǎo)子有協(xié)同效應(yīng)；在生物反應(yīng)器中添加混合誘導(dǎo)子及大孔吸附樹脂NKA-9，其總萘醌含量是對照的4.17倍。米曲霉誘導(dǎo)子、混合誘導(dǎo)子對毛狀根增殖有促進作用；同時添加大孔吸附樹脂NKA-9及混合誘導(dǎo)子能提高毛狀根總萘醌含量。生物反應(yīng)器培養(yǎng)毛狀根為今后利用新疆紫草毛狀根規(guī)?；a(chǎn)總萘醌提供了理論參考。

新疆紫草，毛狀根，總萘醌，真菌誘導(dǎo)子，大孔吸附樹脂

新疆紫草Arnebia euchroma(Royle) Johnst是我國傳統(tǒng)藥用紫草類植物中臨床藥效最好的一種[1-2]，主要化學(xué)成分為萘醌類色素、多糖及脂肪酸，具有抗生育、抗炎、抗腫瘤、殺菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。由于多年的濫采濫挖，新疆紫草野生資源日益減少，造成目前市場供不應(yīng)求的局面，給臨床使用、中成藥加工等帶來很大影響。毛狀根是利用發(fā)根農(nóng)桿菌 Ri質(zhì)粒誘發(fā)的結(jié)果，具有生長迅速、分支多，在無激素培養(yǎng)基上能夠自主、持續(xù)生長，有效成分高且含量穩(wěn)定的特性，是大量生產(chǎn)藥用植物有效成分的新方法。新疆紫草毛狀根[4]提取物具有抑菌[5]、抗氧化[6]作用，可作為原料進行開發(fā)利用。因此，對新疆紫草毛狀根的培養(yǎng)條件進行研究具有重要的現(xiàn)實意義。研究表明真菌誘導(dǎo)子能夠促進和提高紫草細胞[7-11]的萘醌含量，劉長軍等[12]在新疆紫草細胞培養(yǎng)中添加真菌誘導(dǎo)子，發(fā)現(xiàn)黑曲霉誘導(dǎo)子促進紫草素合成效果最好，并且能夠促進細胞紫草素的外排。傅旭慶等[13]在紫草細胞培養(yǎng)中，加入米根霉粗提物可顯著提高紫草寧色素產(chǎn)量，并可加快胞內(nèi)色素分泌到培養(yǎng)液中的速率和數(shù)量。大孔吸附樹脂具有較強的吸附能力，能夠減弱對次生代謝物反饋抑制作用。羅雪梅等[14]在硬紫草細胞培養(yǎng)中添加大孔吸附樹脂，發(fā)現(xiàn)其對紫草素具有良好的吸附能力，可用于細胞培養(yǎng)中紫草素的提取。吳頻梅等[15]采用大孔吸附樹脂吸附分離藏紅花培養(yǎng)液中藏紅花苦素，認為方法可行，前景廣闊。目前還未見到大孔吸附樹脂及真菌誘導(dǎo)子用于新疆紫草毛狀根的研究報道。本研究主要考察了真菌誘導(dǎo)子與大孔吸附樹脂的添加時間、添加量對毛狀根的增殖及總萘醌的積累，對生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)新疆紫草毛狀根進行了初探，旨在為新疆紫草毛狀根的規(guī)模化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料與菌株

新疆紫草毛狀根[4]由本課題組提供；黑曲霉Aspergillusniger與米曲霉Aspergllus oxyzae由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院病理實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

SH培養(yǎng)基[16]，M-9培養(yǎng)基[16]，PDA馬鈴薯真菌培養(yǎng)基，NKA-9大孔吸附樹脂 (日本三菱產(chǎn))，丙酮，無水乙醇、4% NaOH和5 mol/L HCl溶液等。

1.1.3 主要試驗儀器

721-型紫外分光光度計 (武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司)，高壓滅菌鍋 (上海博迅實業(yè)有限公司)，超凈工作臺 (蘇州凈化)，微量移液器(DRAGONMED PROLINE)，電子天平(METTLER TOLEDO)，溫控氣浴搖床 (金壇市精達儀器制造有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱 (上海博迅實業(yè)有限公司)，循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，2 L氣升式生物反應(yīng)器(購于中國科學(xué)院過程工程研究所)。

1.2 方法

由于紫草素及其衍生物的合成呈非偶聯(lián)型，即紫草素及其衍生物是在毛狀根生長停止后才進行合成的，因此，新疆紫草毛狀根的液體培養(yǎng)采用“二階段培養(yǎng)法”：第一階段以毛狀根生物學(xué)產(chǎn)量的增殖為目的，第二階段以毛狀根生產(chǎn)紫草素及其衍生物為目的。具體參見蘆葦華等[16]的方法。

1.2.1 毛狀根擴繁

將2～4 cm的毛狀根接種在裝有50 mL SH培養(yǎng)基的 250 mL錐形瓶中，蔗糖 30 g/L，肌醇1 g/L，水解酪蛋白0.5 g/L。培養(yǎng)液pH 5.8，在20～25 ℃，搖床速度 (100±10) r/min，暗培養(yǎng)條件下進行振蕩培養(yǎng)15 d收獲，備用。

1.2.2 毛狀根生產(chǎn)階段

將 1.2.1培養(yǎng)的毛狀根接種在裝有 100 mL M-9培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，接種量2 g/瓶,培養(yǎng)基pH 5.8，蔗糖30 g/L。在20～25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為 (100±10) r/min下暗培養(yǎng)。培養(yǎng)25 d收獲，滅菌吸水紙吸干其表面水分，稱重，計算毛狀根增殖倍數(shù)。增殖倍數(shù)=(M2?M1)/M1，M1為接種時毛狀根鮮重，M2為培養(yǎng)一定時間后毛狀根鮮重。提取毛狀根總萘醌并測定A516，計算其平均含量。每個處理3次重復(fù)，計算平均值。

1) 真菌誘導(dǎo)子添加量搖瓶試驗。在接種時，分別將米曲霉、黑曲霉按照誘導(dǎo)子勻漿液/M-9培養(yǎng)基體積比為0.5 mL∶50 mL、1 mL∶50 mL、1.5 mL∶50 mL、2 mL∶50 mL 和 2.5 mL∶50 mL的梯度比例添加至M-9培養(yǎng)基中，不添加真菌誘導(dǎo)子為對照 (CK)，對照同樣分做兩組，用于確定未處理同批接種物之間是否存在差異。

2) 真菌誘導(dǎo)子添加時間搖瓶試驗。將黑曲霉按照誘導(dǎo)子勻漿液/M-9培養(yǎng)基體積比為1.5 mL∶50 mL添加?；旌锨拐T導(dǎo)子按照 (米曲霉誘導(dǎo)子勻漿液+黑曲霉誘導(dǎo)子勻漿液)/M-9培養(yǎng)基體積比為 (1+1.5) mL∶50 mL添加。添加時間梯度為培養(yǎng)0 d、5 d、10 d、15 d和20 d。

3) 大孔吸附樹脂NKA-9添加量搖瓶試驗。按照質(zhì)量梯度2 g/瓶、4 g/瓶和6 g/瓶添加大孔吸附樹脂NKA-9于M-9培養(yǎng)基中?；旌锨拐T導(dǎo)子按照 (米曲霉誘導(dǎo)子勻漿液+黑曲霉誘導(dǎo)子勻漿液)/M-9培養(yǎng)基體積比為(1+1.5) mL∶50 mL在培養(yǎng)10 d添加。

4) 真菌誘導(dǎo)子和大孔吸附樹脂的反應(yīng)器試驗。將毛狀根接種在裝有1 700 mL M-9培養(yǎng)基的2 L氣升式反應(yīng)器中，培養(yǎng)基pH 5.8，培養(yǎng)溫度20～25 ℃，通氣量0.4 vvm，接種量90 g，培養(yǎng)第0 d加入51 g活化好的吸附樹脂NKA-9?；旌锨拐T導(dǎo)子按照 (米曲霉誘導(dǎo)子勻漿液+黑曲霉誘導(dǎo)子勻漿液)/M-9培養(yǎng)基體積比為2.5 mL∶50 mL、培養(yǎng)10 d添加 (依據(jù)真菌誘導(dǎo)子添加量搖瓶試驗結(jié)果)。不添加為對照 (CK)。暗培養(yǎng) 25 d收獲，稱重、計算增殖倍數(shù)，測定A516，計算總萘醌含量。

1.2.3 真菌誘導(dǎo)子制備

刮取米曲霉、黑曲霉少量孢子分別接種于PDA真菌液體培養(yǎng)基中，在 25～26 ℃、(120±5) r/min、暗培養(yǎng)5 d收獲菌球，將菌球用蒸餾水充分洗滌后，勻漿2 980×g離心5 min，取沉淀加入 10倍體積的蒸餾水，放入滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min后抽濾，濾液即為真菌誘導(dǎo)子粗提物。分裝濾液，冷藏于冰箱。

1.2.4 大孔吸附樹脂處理

將未使用過的大孔吸附樹脂在丙酮溶液中浸泡5 h，過濾后加入1.5倍的丙酮進行淋洗，然后用蒸餾水沖洗至無色并使溶液顯中性，再用4% NaOH溶液和5 mol/L HCl溶液分別沖洗樹脂，每次都用蒸餾水沖洗至中性，濕法保存待用。

1.2.5 大孔吸附樹脂洗脫及總萘醌含量測定

將吸附了總萘醌的大孔吸附樹脂浸入100 mL無水乙醇中，在25 ℃、100 r/min條件下振搖10 h，用雙層紗布過濾，濾液補充至100 mL，精密量取濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻。采用分光光度法測定A516。萘醌含量=(A516/242)×10×V×n，其中，V為培養(yǎng)液的體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)。每個處理3次重復(fù)，計算平均值及標準差。

1.2.6 毛狀根總萘醌提取及其含量測定

采用中國藥典中記載的測定羥基萘醌總色素的方法進行測定。具體方法：取培養(yǎng)一定時間的毛狀根適量，于50 ℃干燥3 h，粉碎 (過三號篩) 精密稱取約0.5 g，置100 mL 量瓶中，加95%無醇至刻度，4 h內(nèi)時時振搖，過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL于25 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻。采用分光光度法在516 nm的波長處測定吸光度A516，按左旋紫草素(C16H16O5) 的吸收系數(shù)為242 計算，即得毛狀根萘醌含量 (%)=(A516/242)×10×100%。每個處理3次重復(fù)，計算平均值及標準差。

1.2.7 培養(yǎng)液中紫草素及其衍生物的萃取及含量測定

將培養(yǎng)一定時間的毛狀根培養(yǎng)液與等體積的石油醚混合，在分液漏斗中振蕩，靜置，分液，反復(fù)萃取至無色，合并萃取液，采用分光光度法測定萃取液的A516，培養(yǎng)液中萘醌含量=(A516/242)×10×V×n，其中，V為培養(yǎng)液的體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)?？傒刘?毛狀根萘醌含量+培養(yǎng)液萘醌含量。每個處理3次重復(fù)，計算平均值及標準差。

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌誘導(dǎo)子添加量對搖瓶培養(yǎng)的毛狀根增殖倍數(shù)的影響

圖1結(jié)果顯示，米曲霉誘導(dǎo)子不同添加量其毛狀根增殖倍數(shù)均較對照及黑曲霉誘導(dǎo)子高，米曲霉誘導(dǎo)子粗提物/M-9培養(yǎng)基體積比為0.5 mL∶50 mL時，毛狀根增殖倍數(shù)達峰值，為2.55倍；黑曲霉誘導(dǎo)子粗提物/M-9培養(yǎng)基體積比為1.5 mL∶50 mL時，毛狀根增殖倍數(shù)達峰值，為1.28倍。表明低濃度的米曲霉誘導(dǎo)子對毛狀根增殖有較明顯促進效應(yīng)。方差分析結(jié)果表明兩種誘導(dǎo)子之間無顯著差異，但與對照均具有顯著差異 (P=0.05)。

2.2 真菌誘導(dǎo)子添加量對搖瓶培養(yǎng)的總萘醌含量的影響

圖2結(jié)果顯示，凡添加真菌誘導(dǎo)子的總萘醌含量均較對照高，并且隨著添加量的增加，兩種真菌誘導(dǎo)子的總萘醌含量均呈先升后降趨勢，但達峰值的添加量有所不同，且濃度均較低。黑曲霉誘導(dǎo)子添加量在1.5 mL∶50 mL時總萘醌含量為0.85%，米曲霉誘導(dǎo)子添加量在1 mL∶50 mL時為0.81%，兩種誘導(dǎo)子之間無顯著性差異，但與對照均具有顯著差異 (P=0.05)。表明兩種真菌誘導(dǎo)子在低濃度時均可促進萘醌的積累。

圖1 不同誘導(dǎo)子對毛狀根增殖的影響Fig. 1 Effects of different elicitors on hairy roots proliferation. CK: control.

圖2 真菌誘導(dǎo)子添加量對總萘醌含量的影響Fig. 2 Effects of fungal elicitor adding quantity on total naphthoquinone content. CK: control.

2.3 真菌誘導(dǎo)子添加時間對搖瓶培養(yǎng)的毛狀根增殖倍數(shù)的影響

在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，圖3結(jié)果顯示，隨著真菌誘導(dǎo)子添加時間的延遲，兩種真菌誘導(dǎo)子的毛狀根增殖倍數(shù)均呈先升后降趨勢，且均在培養(yǎng)15 d時添加達峰值，添加黑曲霉誘導(dǎo)子、混合誘導(dǎo)子的毛狀根增殖倍數(shù)分別為 7.03倍、6.34倍，方差分析表明，黑曲霉誘導(dǎo)子促進毛狀根增殖效果優(yōu)于混合誘導(dǎo)子 (P=0.01)。表明真菌誘導(dǎo)子具有促進毛狀根增殖的效果。

2.4 真菌誘導(dǎo)子添加時間對搖瓶培養(yǎng)的總萘醌含量的影響

圖3 真菌誘導(dǎo)子添加時間對毛狀根增殖的影響Fig. 3 Effects of fungal elicitor adding time on hairy roots proliferation.

在上述試驗基礎(chǔ)上，圖4結(jié)果顯示，隨著添加時間的延遲，兩種真菌誘導(dǎo)子的總萘醌含量均呈先升后降趨勢，但達峰值的時間有所不同，混合誘導(dǎo)子在培養(yǎng) 10 d時添加其總萘醌含量達峰值為1.55%，黑曲霉誘導(dǎo)子在培養(yǎng)5 d時添加總萘醌含量達峰值為 1.50%，兩者之間無顯著差異，但兩者與對照相比均有顯著差異 (P=0.05)，分別較對照高0.87%、0.42%。即黑曲霉誘導(dǎo)子處理的萘醌積累時間長，要早添加，如果延遲添加，萘醌含量下降但幅度較小?；旌险T導(dǎo)子處理的萘醌積累所需時間稍短，如果延遲添加，萘醌含量下降且幅度較大。表明黑曲霉誘導(dǎo)子的作用效應(yīng)較混合誘導(dǎo)子的弱，黑曲霉誘導(dǎo)子與米曲霉有協(xié)同效應(yīng)。

試驗發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)5 d時添加真菌誘導(dǎo)子，兩種處理的培養(yǎng)液萘醌含量基本一致，總萘醌含量以黑曲霉誘導(dǎo)子處理的效果優(yōu)于混合誘導(dǎo)子的處理 (圖4)，進一步說明黑曲霉誘導(dǎo)子與米曲霉具有協(xié)同效應(yīng)，混合誘導(dǎo)子中的米曲霉誘導(dǎo)子具有促進萘醌類物質(zhì)向細胞外釋放的作用。

2.5 大孔吸附樹脂添加量對搖瓶培養(yǎng)的毛狀根增殖及總萘醌含量的影響

圖4 真菌誘導(dǎo)子添加時間對總萘醌含量的影響Fig. 4 Effects of fungal elicitor adding time on total naphthoquinone content.

圖 5 大孔吸附樹脂添加量對毛狀根增殖和萘醌積累的影響Fig. 5 Effects of macroporous adsorption resin adding quantity on hairy roots proliferation and total naphthoquinone content.

在2.4試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，圖5結(jié)果顯示，隨著大孔吸附樹脂添加量的增加，毛狀根增殖倍數(shù)呈下降趨勢，添加量為2 g/瓶時毛狀根增殖倍數(shù)最高為 8.17倍，明顯較對照高 (P=0.05)，是對照的1.38倍。添加樹脂的3個處理總萘醌含量均明顯較對照高，大孔吸附樹脂添加量為4 g/瓶時總萘醌含量最高為5.49%，是對照的3.71倍。表明添加樹脂明顯促進萘醌類物質(zhì)的合成和積累，綜合考慮毛狀根增殖及萘醌含量，以添加2 g/瓶的樹脂為宜。3個處理間萘醌含量無明顯差異。

2.6 混合誘導(dǎo)子、大孔吸附樹脂對反應(yīng)器中的毛狀根增殖倍數(shù)及總萘醌含量的影響

在上述試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，單獨添加混合誘導(dǎo)子及混合誘導(dǎo)子與大孔吸附樹脂同時添加，圖6結(jié)果顯示，毛狀根增殖倍數(shù)及總萘醌含量均高于對照，以混合誘導(dǎo)子與大孔吸附樹脂同時添加的毛狀根增殖倍數(shù)及總萘醌含量最高，分別為4.23倍、4.5%，總萘醌含量是對照的4.17倍。表明混合誘導(dǎo)子與大孔吸附樹脂共同作用有利于毛狀根萘醌類物質(zhì)在反應(yīng)器中的合成及向培養(yǎng)液中分泌。至于總萘醌含量較搖瓶培養(yǎng)低的原因可能是毛狀根在反應(yīng)器中的各項參數(shù)不同所致，有待進一步研究。

圖6 不同處理對毛狀根增殖、萘醌積累的影響Fig. 6 Effects of different treatment on hairy roots proliferation and naphthoquinone accumulation. CK:control.

3 討論

3.1 真菌誘導(dǎo)子與植物次生代謝物

許多研究表明，真菌誘導(dǎo)子的種類、濃度及添加時間影響植物次生代謝物的產(chǎn)量。劉峻等[9]研究認為黑曲霉誘導(dǎo)子能提高人參毛狀根總苷含量，并可促進人參毛狀根的生長。王劍文等[17]采用黃花蒿內(nèi)生炭疽菌細胞壁寡糖提取物處理可促進毛狀根青蒿素的合成，青蒿素含量較對照高出64.29%。晏瓊等[18]、王學(xué)勇等[19]認為酵母提取物與非生物誘導(dǎo)子具有協(xié)同作用，其誘導(dǎo)效果比單獨使用某一種誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)效果更好，這種相互作用可以更有效地促進次生代謝產(chǎn)物的合成。在紫草細胞培養(yǎng)的研究中，劉長軍等[12]對 4種真菌誘導(dǎo)子的作用研究認為，黑曲霉誘導(dǎo)子對紫草細胞次生代謝產(chǎn)物效果最好，而寧文等[20]則認為米曲霉誘導(dǎo)子效果最好。本研究中，單獨使用黑曲霉誘導(dǎo)子及添加混合曲霉誘導(dǎo)子均能促進萘醌的積累，這一結(jié)果與劉峻等[9]、晏瓊等[18]、劉長軍等[12]、寧文等[20]的一致?？梢姴煌N類的真菌誘導(dǎo)子適合不同的培養(yǎng)材料，真菌誘導(dǎo)子促進細胞次生代謝物含量的提高具有普遍性。

在毛狀根培養(yǎng)過程中，真菌誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)效果與誘導(dǎo)子濃度、作用時間密切相關(guān)[18]，這可能與真菌誘導(dǎo)子的組分[21]抑或含量有關(guān)，而這又取決于真菌的培養(yǎng)時間及培養(yǎng)條件。王紅等[22]采用大麗花輪枝孢、葡枝根霉和束狀刺盤孢等3種真菌誘導(dǎo)子處理青蒿毛狀根，均能促進毛狀根中青蒿素的積累，在加入誘導(dǎo)子4 d后毛狀根中的青蒿素含量最高。寧文等[21]在顛紫草細胞培養(yǎng)第8 d時加入米曲霉誘導(dǎo)子，12 h后細胞內(nèi)的紫草素含量即開始增加。傅旭慶等[13]在6 d加入米根霉，促進紫草細胞中紫草素含量提高的作用最大，較對照高2.24倍。本研究中采用培養(yǎng)5 d的米曲霉、黑曲霉誘導(dǎo)子，在毛狀根培養(yǎng)5 d、10 d時添加，總萘醌含量均達最高，此結(jié)果與寧文等[21]、傅旭慶等[13]類似，表明不適宜的添加時間影響毛狀根的生長代謝，從而影響總萘醌的合成。

3.2 大孔吸附樹脂的作用

羅雪梅等[14]在硬紫草細胞培養(yǎng) 4 d時加入R-A樹脂色素產(chǎn)量提高兩倍；謝文化等[23]認為樹脂的添加量為 6.7%時，色素的產(chǎn)量比常規(guī)培養(yǎng)分別增加了5.2倍、6倍。反應(yīng)器與AB-8樹脂柱相偶聯(lián)進行同時分離色素的培養(yǎng)實驗，結(jié)果使色素產(chǎn)量增加了5.3倍。孟琴等[24]在培養(yǎng)硬紫草細胞8 d時加入大孔吸附樹脂，繼續(xù)培養(yǎng)6 d后，紫草素產(chǎn)率提高了76.4%；曹琳等[25]在丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的研究中認為大孔樹脂 X-5可以在丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的過程中有效地對丹參酮進行原位富集，總丹參酮吸附率達到92.4%。上述研究表明，無論是細胞培養(yǎng)還是毛狀根培養(yǎng)，大孔吸附樹脂均具有使細胞內(nèi)次生代謝物向外不斷排放、從而使其產(chǎn)量提高的作用。蘆韋華等[26]單獨添加大孔吸附樹脂 NKA-9總萘醌含量為3.64%。本研究添加大孔吸附樹脂NKA-9同時加入混合誘導(dǎo)子總萘醌含量較對照增加了3.71倍，表明大孔吸附樹脂與真菌誘導(dǎo)子具有協(xié)同作用。當培養(yǎng)25 d后毛狀根呈無色半透明狀，培養(yǎng)液為淡黃色，NKA-9樹脂呈紫紅色，說明總萘醌在新疆紫草毛狀根和培養(yǎng)液中的含量極低，表明大孔吸附樹脂 NKA-9具有降低細胞內(nèi)萘醌濃度的作用，這與羅雪梅[14]、謝文化[23]、孟琴[24]、曹琳[25]等的研究結(jié)果一致。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，對照的培養(yǎng)液中萘醌含量不到 0.1%，說明萘醌主要積累在毛狀根內(nèi)，添加樹脂的毛狀根、培養(yǎng)液中萘醌含量均為0，說明毛狀根合成的所有萘醌被大孔吸附樹脂所吸附，萘醌未在毛狀根內(nèi)產(chǎn)生積累，表明新疆紫草毛狀根在培養(yǎng)過程中添加大孔吸附樹脂及真菌誘導(dǎo)子可有效克服萘醌的反饋抑制現(xiàn)象，從而大幅度提高萘醌產(chǎn)量。本研究采用3種真菌誘導(dǎo)子及大孔吸附樹脂進行研究，結(jié)果表明混合曲霉誘導(dǎo)子10 d添加的萘醌含量略高于黑曲霉誘導(dǎo)子5 d添加的，筆者推測米曲霉誘導(dǎo)子具有促進毛狀根萘醌的釋放效果，因此認為混合曲霉誘導(dǎo)子效果最好，但其成分及最適比例有待進一步研究。

根據(jù)本研究結(jié)果綜合考慮，毛狀根生產(chǎn)萘醌過程中大孔吸附樹脂與真菌誘導(dǎo)子具有協(xié)同作用，且添加大孔吸附樹脂尤為重要。試驗表明過量的樹脂影響毛狀根生長，降低萘醌總產(chǎn)量，增加成本，因此綜合考慮大孔吸附樹脂 NKA-9添加量不超過4 g/100 mL為宜。

4 結(jié)論

毛狀根培養(yǎng)10 d時按照混合誘導(dǎo)子與M-9培養(yǎng)基為2.5 mL∶50 mL的體積比添加可促進萘醌積累。大孔吸附樹脂與真菌誘導(dǎo)子具有協(xié)同作用，可大幅提高新疆紫草毛狀根萘醌含量(5.49%)，此結(jié)果為新疆紫草毛狀根規(guī)?；a(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

致謝：感謝新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院羅明教授在翻譯修改上所提供的幫助。

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September 22, 2012; Accepted: November 19, 2012

Fang Wang. Tel: +86-991-8762261; E-mail: Wangfang1hao@126.com

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金 (No. 200821170) 資助。

Influence of fungal elicitor and macroporous resin on shikonin accumulation in hairy roots ofArnebia euchroma(Royle) Johnst

Pu Zhang, Fang Wang, and Chashan Zhu

College of Agronomy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi830052,Xinjiang,China

In order to investigate the effects of fungal elicitor and macroporous adsorption resin on shikonin accumulation in hairy roots of arnebia euchroma (Royle) Johnst, we used spectrophotometry to determine the total naphthoquinone content of the hairy roots, by adding different volume ratio ofAspergillus nigerelicitor,Aspergillus oryzaeelicitor, and the macroporous resin into the M-9 liquid medium at different culture time. The results show that the total naphthoquinone content was 2.28 times higher than the control when we added mixed elicitorsof Aspergillus nigerandAspergillus oryzaeat the ratio of 2.5:50 in the 10th day of hairy roots cultivating. The total naphthoquinone content was 3.71 times higher than that of the control, when we added macroporous adsorption resin NKA-9.Aspergillus nigerelicitor exhibited synergistic effect withAspergillus oryzaeelicitor to enhance the naphthoquinone. Also, the total naphthoquinone level was 4.17 times higher than that of the control by adding mixed fungal elicitor and macroporous adsorption resin NKA-9 in the bioreactor.Aspergillus oryzaeand mixed elicitor could promote the hairy roots proliferation, and macroporous adsorption resin NKA-9 and mixed elicitor increased the total naphthoquinone content. In summary, the measure developed forArnebia euchroma(Royle) Johnst hairy roots cultivating in bioreactors may potential for large-scale production of naphthoquinone.

Arnebia euchroma(Royle) Johnst, hairy roots, shikonin, fungal elicitor, macroporous adsorption resin

Supported by: Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region of China (No. 200821170).

(本文責編 陳宏宇)