李鵬飛，孫紅兵，游麗金，鞏伏雨，陳藻，張愛聯(lián)，朱泰承

1 海南大學農(nóng)學院，海南 海口 5702282 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點開放實驗室，海南 ?？?5711013 中國科學院微生物研究所，北京 1001014 廈門大學化學化工學院，福建 廈門 361005

利用畢赤酵母系統(tǒng)直接分泌表達具有活性的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶

李鵬飛1，孫紅兵3，游麗金3，鞏伏雨3，陳藻4，張愛聯(lián)2，朱泰承3

1 海南大學農(nóng)學院，海南 海口 570228
2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點開放實驗室，海南 ?？?571101
3 中國科學院微生物研究所，北京 100101
4 廈門大學化學化工學院，福建 廈門 361005

李鵬飛, 孫紅兵, 游麗金, 等. 利用畢赤酵母系統(tǒng)直接分泌表達具有活性的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶. 生物工程學報, 2013,29(2): 180?188.

Li PF, Sun HB, You LJ, et al. Direct secretory expression of active microbial transglutaminase inPichia pastoris. Chin J Biotech, 2013, 29(2): 180?188.

使用異源表達系統(tǒng)直接分泌表達具有活性的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶 (Microbial transglutaminase，MTG) 是目前最具前景的MTG生產(chǎn)方法之一，但由于產(chǎn)量較低無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。畢赤酵母是近年來發(fā)展出的高效蛋白表達系統(tǒng)。通過采用pro序列與成熟MTG基因共表達的策略，成功地實現(xiàn)了用重組畢赤酵母分泌表達具有活性的茂原鏈霉菌Streptomyces mobaraenseMTG。進一步通過對pro序列和MTG基因拷貝數(shù)以及重組酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最終使得MTG在1 L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵的酶活達到7.3 U/mL，為MTG的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，畢赤酵母，拷貝數(shù)，共表達，高密度發(fā)酵，酶原序列

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶 (Transglutaminase，又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，EC 2.3.2.13，TGase或TG) 能夠催化蛋白質(zhì)肽鏈中谷氨酰胺殘基的 γ-羧酰胺基與各種酰基受體發(fā)生酰胺基轉(zhuǎn)移反應，是一種有效的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑[1-2]。TG廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中，特別是微生物來源的 TG(Microbial transglutaminase，MTG)，在無 Ca2+的條件下依然可以表現(xiàn)出催化活性，被廣泛用于食品工業(yè)以改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)、提高營養(yǎng)價值[1]。近些年，MTG在化妝品行業(yè)、紡織業(yè)、皮革業(yè)及生物材料領(lǐng)域也表現(xiàn)出良好的應用前景[1,3]。

MTG在工業(yè)上是通過微生物發(fā)酵法制備，生產(chǎn)菌株最初是從土壤中篩選到的鏈霉菌，如茂原鏈霉菌Streptomyces mobaraense[4]、吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus[5]等。鏈霉菌MTG是一種胞外酶，以無活性的酶原 (pro-MTG) 形式分泌，pro-MTG被胞外蛋白酶SAM-P45切除N-端酶原區(qū) (pro序列) 后，轉(zhuǎn)化成成熟的具有活性的MTG[6]。近些年，用重組表達系統(tǒng)來生產(chǎn)MTG成為研究的主要方向，最為成功的系統(tǒng)有大腸桿菌[7-9]、棒桿菌[10-11]和甲基營養(yǎng)型酵母[12]。迄今為止，直接克隆表達成熟MTG編碼區(qū)的策略均未獲得成功[2]。因此，目前 MTG的表達策略主要分為兩類，第一類是以酶原形式表達 (或無活性表達)，在體外用SAM-P45蛋白酶去除pro序列獲得活性 MTG[13-14]。雖然以酶原形式表達目前可以積累高達2.5 g/L的酶原蛋白[13]，但體外蛋白酶的處理步驟無疑提高了生產(chǎn)成本和操作的復雜度。第二類是以成熟MTG形式表達 (或活性表達)。早期的工作是將pro-MTG與SAM-P45蛋白酶在異源宿主中共同分泌表達[15-16]，但該策略表達水平很低，且蛋白酶的后續(xù)去除也會提高分離純化的成本。2004年，Yurimoto等首先采用了將MTG酶原的pro序列和成熟MTG編碼區(qū)作為兩個獨立的元件進行共表達的策略，成功地實現(xiàn)了用甲基營養(yǎng)型酵母C. boidinii分泌表達活性MTG[12]，產(chǎn)量達到1.83 U/mL。采用此策略，Liu等也在大腸桿菌中獲得了MTG的活性表達[17]，產(chǎn)量達到0.13 U/(mL·OD600)。但目前報道的共表達策略酶活水平仍然較低，離工業(yè)化應用還有較大的差距。

甲基營養(yǎng)型酵母畢赤酵母Pichia pastoris是近20年發(fā)展起來的一種高效異源蛋白表達系統(tǒng)，它的許多優(yōu)良特點[18-19]使其成為蛋白分泌表達的首選系統(tǒng)之一。本研究通過使用重組畢赤酵母菌株表達MTG并對重組菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，使得MTG在1 L發(fā)酵罐中的產(chǎn)量達到7.3 U/mL，初步證明了利用畢赤酵母直接分泌表達具有活性的MTG的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌E. coliDH5α、Pichia pastorisGS115以及質(zhì)粒pAOα[20]均為本實驗室保存。

1.1.2 酶、試劑、引物和DNA序列測定

所有核酸限制性內(nèi)切酶購自 NEB公司。DNA 連接酶 (SolutionⅠ)、DNA Marker、TaqDNA聚合酶以及蛋白Marker購自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒、小片段DNA回收試劑盒以及瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒購自 OMEGA公司。引物合成和DNA測序由北京擎科生物有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)用LB和LLB培養(yǎng)基，畢赤酵母菌培養(yǎng)用的培養(yǎng)基 YPD、MD、BMGY、BMMY、BSM配方見Invitrogen公司提供的操作手冊[21]。

1.2 方法

1.2.1 成熟谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶 (MTG) 基因和pro序列基因的克隆

根據(jù) GenBank提供的 pro-MTG基因序列(GenBank Accession No. AY502065.1)，分別設(shè)計成熟 MTG基因的擴增引物 mtgF (引入XhoⅠ)和mtgR (引入EcoRⅠ)，以及pro序列的擴增引物proF (引入XhoⅠ) 和proR (引入EcoRⅠ)。

以茂原鏈霉菌菌株基因組為模板，PCR擴增MTG基因。PCR條件為：95 ℃預變性5 min；94 30 s℃，55 30 s℃，72 ℃ 80 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后與pMD19-T simple載體連接，轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α感受態(tài)細胞，提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，膠回收后得到MTG片段。利用同樣的方法得到pro片段，PCR條件中延伸時間為20 s。

1.2.2 pro/MTG共表達載體pAOα-pro-MTG的構(gòu)建

將分泌型表達載體 pAOα利用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，通過膠回收得到線性化質(zhì)粒載體，然后與得到的MTG片段通過DNA連接酶SolutionⅠ連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，獲得MTG基因單拷貝誘導表達載體pAOα-MTG。利用同樣的方法獲得載體 pAOα-pro。將得到的載體 pAOα-pro利用BamHⅠ線性化后，通過膠回收得到線性化質(zhì)粒載體；同時將構(gòu)建的載體pAOα-MTG利用BamHⅠ和BglⅡ雙酶切，膠回收MTG基因表達盒；將線性化質(zhì)粒載體與MTG基因表達盒通過 SolutionⅠ連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得pro/MTG共表達載體pAOαpro-MTG。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.3 多拷貝pro/MTG共表達載體的構(gòu)建

將得到的載體pAOα-pro-MTG利用BamHⅠ線性化后，通過膠回收得到線性化質(zhì)粒載體；同時將pAOα-pro-MTG利用BamHⅠ和BglⅡ雙酶切，膠回收 pro/MTG基因表達盒；將該表達盒與線性化質(zhì)粒載體通過 SolutionⅠ連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得2拷貝pro/MTG共表達載體pAOα-2pro-2MTG。同樣的策略，得到3拷貝pro/MTG共表達載體pAOα-3pro-3MTG。

1.2.4 酵母的電轉(zhuǎn)化及重組子的篩選

將構(gòu)建的表達載體pAOα-pro-MTG、pAOα-2pro-2MTG、pAOα-3pro-3MTG分別通過限制性內(nèi)切酶StuⅠ單酶切后，膠回收得到線性化質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞。具體操作參照Invitrogen公司提供的操作手冊[21]。將得到的重組子通過PCR鑒定，從而得到含有MTG基因的重組畢赤酵母表達菌株。

1.2.5 重組菌株的搖瓶表達及MTG酶活測定

將得到的重組菌株利用BMGY培養(yǎng)基活化，然后以相同的接種量轉(zhuǎn)移菌體到BMMY中進行誘導表達，搖瓶發(fā)酵表達MTG的方法按照Invitrogen公司提供的操作手冊。搖瓶培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r/min，每12 h添加8‰甲醇，共誘導96 h。得到的發(fā)酵上清液用于酶活測定。MTG酶活的定義為：37 ℃時 MTG每分鐘催化底物(N-CBZ-Gln-Gly, Sigma公司) 生成 1 mmol/mL谷氨酸-單羥胺酸 (氧肟酸) 為 1個酶活單位。MTG酶活的測定方法按照參考文獻[21]進行。

1.2.6 重組菌株GS2MTG搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

從 pH和培養(yǎng)基兩方面優(yōu)化 GS2MTG表達MTG的發(fā)酵條件。pH優(yōu)化方面，將 GS2MTG在YPD中培養(yǎng)24 h，收集菌體并分別接種至不同pH的BMMY培養(yǎng)基中，將pH調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，誘導培養(yǎng)96 h后，取樣測定OD600和酶活。培養(yǎng)基優(yōu)化方面，將GS2MTG在YPD中培養(yǎng)24 h，收集菌體并分別接種至BMMY、BSM和12%麥芽汁培養(yǎng)基 (麥芽汁12 g，加蒸餾水溶解定容至100 mL)，誘導培養(yǎng)96 h后，取樣測定OD600和酶活。

1.2.7 1 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)

高密度發(fā)酵在1 L發(fā)酵罐中進行，將經(jīng)過搖瓶活化的重組子菌液作為種子液接種于 700 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，將發(fā)酵的參數(shù)設(shè)定為pH 6.0，攪拌轉(zhuǎn)速100～750 r/min，通氣量1 L/min 和溫度30 ℃。發(fā)酵約24 h后，當溶氧值升高并維持較高水平時，開始采用流加策略補加50%甘油，維持溶氧值在 10%左右。待發(fā)酵液OD600值達到250～300時停止補料，開始補加100%甲醇誘導，根據(jù)溶氧水平控制補料速率，整個發(fā)酵過程中控制溶氧水平為5%～10%。發(fā)酵過程中每24 h取樣測定OD600和酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆和載體構(gòu)建

以茂原鏈霉菌菌株基因組為模板，利用引物mtgF和mtgR，proF和proR通過PCR得到MTG成熟肽基因和 pro基因，PCR產(chǎn)物大小分別為1 021 bp和 160 bp，電泳結(jié)果顯示與預期相符(結(jié)果未顯示)。PCR產(chǎn)物分別連接T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，提質(zhì)粒后測序，確認MTG基因和pro基因序列與公布序列完全一致。按方法1.2.2所述，構(gòu)建獲得pro/MTG共表達載體pAOα-pro-MTG (圖1)，作為基本的表達單元。為考察拷貝數(shù)對MTG產(chǎn)量的影響，進一步按方法1.2.2所述，分別構(gòu)建得到2拷貝、3拷貝表達載體，分別命名為 pAOα-2pro-2MTG、pAOα-3pro-3MTG，并通過BamHⅠ和BglⅡ雙酶切驗證，切出片段大小與理論值完全相符 (結(jié)果未顯示)。

2.2 重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建和pro/MTG拷貝數(shù)的優(yōu)化

圖1 共表達載體pAOα-pro-MTG質(zhì)粒圖Fig. 1 Plasmid map of co-expression vector pAOαpro-MTG

將得到的質(zhì)粒載體pAOα-pro-MTG、pAOα-2pro-2MTG、pAOα-3pro-3MTG 分別利用StuⅠ在HIS基因處線性化，通過雙交換整合到畢赤酵母基因組中。雙交換會使畢赤酵母從組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株轉(zhuǎn)變?yōu)榉侨毕菪途?，從而使重組菌株可以在缺乏組氨酸的MD平板上生長。每個平板挑取3～5個單菌落，利用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取基因組，通過PCR證明MTG基因已經(jīng)整合到畢赤酵母基因組中，通過定量 PCR驗證所整合的MTG基因拷貝數(shù)與預想值一致 (結(jié)果未顯示)，得到的 1～3拷貝的重組酵母菌株分別命名為GS1MTG、GS2MTG和GS3MTG。

將以上3株菌株分別接種BMMY進行搖瓶發(fā)酵，以GS115作為對照。搖瓶誘導發(fā)酵96 h后測酶活，結(jié)果如圖2所示。GS1MTG、GS2MTG和 GS3MTG均實現(xiàn)了活性表達，它們的酶活分別達到0.18、0.25和0.22 U/mL，其中以2拷貝菌株GS2MTG產(chǎn)量最高，因此選取GS2MTG作為后續(xù)研究。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

首先考察了不同 pH值對畢赤酵母生長及MTG生產(chǎn)水平的影響。將GS2MTG菌株分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的BMMY中誘導培養(yǎng)96 h，發(fā)酵結(jié)束后檢測菌體的光密度值和MTG酶活。由圖3可以看出，pH值的變化對于菌體生長的影響并不顯著，但對MTG產(chǎn)量的影響顯著。在pH值為6.0和7.0時，產(chǎn)酶量最高。特別是當pH偏酸時會顯著降低MTG的酶活產(chǎn)量。

圖 2 各重組畢赤酵母菌株表達 MTG酶活的比較(GS115為陰性對照，GS1MTG、GS2MTG和GS3MTG分別為含有pro/mtg共表達盒1拷貝、2拷貝和3拷貝重組菌株)Fig. 2 MTG activities of constructed recombinant Pichia pastoris strains. GS115 is utilized as negative control, GS1MTG, GS2MTG and GS3MTG are recombinant strains that contain one copy, two copies and three copies of pro/mtg co-expression cassettes.

圖3 不同pH對GS2MTG生長和產(chǎn)酶的影響Fig. 3 Effect of different pH on GS2MTG growth and enzyme production.

由于BMMY培養(yǎng)基成本較高，考察了替代培養(yǎng)基：鹽培養(yǎng)基 (BSM) 和麥芽汁培養(yǎng)基對于菌株生長和產(chǎn)酶的影響。由圖4可以看出，在誘導培養(yǎng)96 h后，BSM培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基的細胞量分別比BMMY培養(yǎng)基低39%和8%。從MTG產(chǎn)量方面，麥芽汁培養(yǎng)基中的MTG活性為BMMY培養(yǎng)基的78%，而BSM培養(yǎng)基中僅能檢測到微量的酶活。

2.4 重組畢赤酵母GS2MTG在1 L發(fā)酵罐中MTG的產(chǎn)量評估

為評估畢赤酵母菌株分泌表達活性MTG的潛力，綜合以上研究結(jié)果，將 GS2MTG菌株在pH 6.0的條件下，以BMGY和BMMY為培養(yǎng)基誘導發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果見圖5。整個誘導過程持續(xù)120 h，酶活最終達到7.3 U/mL。

圖4 不同培養(yǎng)基對GS2MTG生長和產(chǎn)酶影響Fig. 4 Effects of alternative media on GS2MTG growth and enzyme production.

圖5 不同誘導時間GS2MTG的生長和產(chǎn)酶情況Fig. 5 Growth and enzyme production of GS2MTG at different induction time.

3 討論

Yurimoto等首先采用了MTG的pro序列和MTG成熟編碼區(qū)共表達的策略，實現(xiàn)了在甲基營養(yǎng)型酵母C. Boidinii中分泌表達具有活性的MTG[12]。鑒于畢赤酵母在蛋白表達上的成功應用，本研究將此共表達策略應用于畢赤酵母中，成功地實現(xiàn)了MTG的活性分泌表達。本研究還對 pro/MTG的拷貝數(shù)進行了優(yōu)化，結(jié)果表明 2拷貝的pro/MTG菌株GS2MTG，比單拷貝菌株的產(chǎn)量提高了約40%。但是進一步提高拷貝數(shù)沒有提高MTG的表達量，反而使其有所下降。前人研究表明，增加外源基因拷貝數(shù)可以有效提高其蛋白分泌表達量，但過高的拷貝數(shù)有可能會對蛋白的表達乃至酵母宿主的生長產(chǎn)生負影響[22-23]。本研究結(jié)果表明，對于畢赤酵母分泌表達MTG，2拷貝的pro/MTG是最優(yōu)結(jié)果。此時基因劑量已經(jīng)不再是MTG分泌表達的主要限制性因素，而蛋白表達的其他環(huán)節(jié)如蛋白翻譯、分泌等，可能會成為影響MTG產(chǎn)量的主要瓶頸。

從培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化實驗可以看出，pH值對于MTG的酶活有顯著影響，pH值低于6.0和高于 7.0都會使酶活降低，特別是在低于 6.0時，酶活下降顯著，這意味著在MTG發(fā)酵培養(yǎng)中對于pH值的控制是十分重要的。蛋白電泳結(jié)果表明在低pH的情況下MTG蛋白表達量顯著降低 (結(jié)果未顯示)，這說明 pH是在蛋白質(zhì)表達水平影響MTG產(chǎn)量的。pH對MTG表達的影響可能跟MTG的降解過程有關(guān)，合適的pH可抑制酵母蛋白酶活力從而抑制其對外源蛋白的降解[24]。

從培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果來看，12%的麥芽汁培養(yǎng)基與BMMY培養(yǎng)基相比，無論是細胞量還是最終MTG產(chǎn)量，都只比BMMY培養(yǎng)基略低，一定程度上可以代替BMMY培養(yǎng)基。而用廉價的BSM 培養(yǎng)基替代 BMMY培養(yǎng)基的實驗并不成功，不但菌株生長明顯減緩，更重要的是在BSM培養(yǎng)基中僅能檢測到微弱的MTG活性，蛋白電泳的結(jié)果也顯示MTG的條帶很微弱 (結(jié)果未顯示)。這是因為在外源蛋白表達過程中，宿主細胞為外源蛋白提供前體和能量，其良好的生長狀態(tài)是實現(xiàn)外源蛋白高效表達的必要條件[25]。BMMY和12%的麥芽汁培養(yǎng)基與BSM培養(yǎng)基相比，含豐富的有機氮源，酵母菌在此兩種富營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長更加迅速，前體和能量供給更加充沛，因此MTG的表達量更高。另外，有機氮源如酵母提取物、蛋白胨可以作為蛋白酶的底物，從而減少對目的蛋白的降解[26]。

最后，用最優(yōu)的菌株 GS2MTG在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下進行了高密度發(fā)酵，經(jīng)誘導120 h，MTG產(chǎn)量達到7.3 U/mL，比搖瓶產(chǎn)量提高了近30倍，這也表明了發(fā)酵過程中嚴格控制的pH值、良好的溶氧環(huán)境，對于MTG的產(chǎn)量提高是至關(guān)重要的。該產(chǎn)量也是迄今為止，采用活性表達策略的報道中最高的。研究同時也表明了畢赤酵母作為MTG生產(chǎn)菌株的良好應用前景。

[1]Yokoyama K, Nio N, Kikuchi Y. Properties and applications of microbial transglutaminase. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64(4): 447?454.

[2]Liu S, Zhang DX, Du GC, et al. Progress in expression and molecular modification of microbial transglutaminase. Chin J Biotech, 2011, 12(27):1681?1689 (in Chinese).

劉松, 張東旭, 堵國成, 等. 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達及分子改造研究進展. 生物工程學報, 2011, 12(27): 1681?1689.

[3]Zhu Y, Tramper J. Novel applications for microbial transglutaminase beyond food processing. Trends Biotechnol, 2008, 26(10): 559?565.

[4]Ando H, Adachi M, Umeda K, et al. Purification and characteristics of a novel transglutaminase derived from microorganisms. Trends Biotechnol,1989, 10(53): 2613?2617.

[5]Cui L, Du G, Zhang D, et al. Thermal stability and conformational changes of transglutaminase from a newly isolatedStreptomyces hygroscopicus.Bioresour Technol, 2008, 99(9): 3794?3800.

[6]Pasternack R, Dorsch S, Otterbach JT, et al.Bacterial pro-transglutaminase fromStreptoverticillium mobaraensepruification,characterisation and sequence of the zymogen. Eur J Biochem, 1988, 257(3): 570?576.

[7]Zhao X, Shaw AC, Wang J, et al. A novel high-throughput screening method for microbial transglutaminase with high specificity toward Gln141 of human growth hormone. J Biomol Screen, 2010, 15(2): 206?212.

[8]Liu XQ, Yang XQ, Xie FH, et al. On-column refolding and puriwcation of transglutaminase fromStreptomyces fradiaeexpressed as inclusion bodies inEscherichia coli. Protein Expr Purif, 2007,51(2): 179?186.

[9]Yang H, Pan L, Lin Y. Purification and on-column activation of a recombinant histidine-tagged pro-transglutaminase after soluble expression inEscherichia coli. Biosci Biotechnol Biochem, 2009,73(11): 2531?2534.

[10]Masayo D, Kei-Ichi Y, Yukiko U, et al. High level expression ofStreptomyces mobaraensistransglutaminase inCorynebacterium glutamicumusing achimeric pro-region fromStreptomyces cinnamoneustransglutaminase. J Biotechnol, 2004,3(110): 219?226.

[11]Date M, Yokoyama K, Umezawa Y, et al.Production of native-typeStreptoverticilliummobaraensetransglutaminase inCorynebacterium glutamicum. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(5):3011?3014.

[12]Yurimoto H, Yamane M, Kikuchi Y, et al. The pro-peptide ofStreptomyces mobaraensistransglutaminase functions in cis and in trans to mediate efficient secretion of active enzyme from methylotrophic yeasts. Biosci Biotechnol Biochem,2004, 68(10): 2058?2069.

[13]Itaya H, Kikuchi Y. Secretion ofStreptomyces mobaraensispro-transglutaminase by coryneform bacteria. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(4):621?625.

[14]Sommer C, Volk N, Pietzsch M. Model based optimization of the fed-batch production of a highly active transglutaminase variant inEscherichia coli.Protein Expr Purif, 2011, 77(1): 9?19.

[15]Zhao X, Shaw AC, Wang JH, et al. A novel high-throughput screening method for microbial transglutaminases with high specificity toward Gln141 of human growth hormone. J Biomol Screen, 2010, 15(2): 206?212.

[16]Kikuchi Y, Date M, Yokoyama K, et al. Secretion of active-formStreptoverticillium mobaraensetransglutaminase byCorynebacterium glutamicum:processing of the pro-transglutaminase by a cosecreted subtilisin-like protease fromStreptomyces albogriseolus. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(1): 358?266.

[17]Liu S, Zhang DX, Wang M, et al. The order of expression is a key factor in the production of active transglutaminase inEscherichia coliby co-expression with its pro-peptide. Microb Cell Fact, 2011, 23(10): 112.

[18]Cereghino J L, Cregg J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeastPichia pastoris. FEMS Microbiol Rev, 2000, 1(24):45?46.

[19]Cregg J M, Cereghino J L, Shi J, et al.Recombinant protein expression inPichia pastoris.Mol Biotechnol, 2000, 1(16): 23?52.

[20]Zhu TC, You LJ, Gong FY, et al. Combinatorial strategy of sorbitol feeding and low-temperature induction leads to high-level production of alkaline-mannanase inPichia pastoris. Enzyme Microb Tech, 2011, 49(4): 407?412.

[21]Bao YL, Pan L. Research progress of mechanism and activity assay of microbial transglutaminase .Sci Technol Food Ind, 2008, 29(7): 265?268 (in Chinese).

包瑩玲, 潘力. 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用機制及檢測方法研究進展. 食品工業(yè)科技, 2008,29(7): 265?268.

[22]Zhu T, Guo M, Tang Z, et al. Efficient generation of multi-copy strains for optimizing secretory expression of porcine insulin precursor in yeastPichia pastoris. J Appl Microbiol, 2009, 107:954?963.

[23]Guo MJ, Zhu TC, Zhang M, et al. Influences of methanol utilization phenotype and gene dosage on heterologous protein expression in recombinantPichia pastoris. China Biotechnol, 2007, 27(7):7?11 (in Chinese).

郭美錦, 朱泰承, 張明, 等. 重組畢赤酵母甲醇利用表型與基因拷貝數(shù)對外源基因表達的影響.中國生物工程雜志, 2007, 27(7): 7?11.

[24]Lin JH. High density fermentation control ofPichia pastoris. China Biotechnol, 2009, 29(5): 120?125(in Chinese).

林俊涵. 畢赤酵母高密度發(fā)酵工藝的研究. 中國生物工程雜志, 2009, 29(5): 120?125.

[25]Cos Q, Ramon R, Montesinos JL, et al. Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophic yeastPichia pastorisunder different promoters: a review.Microb Cell Fact, 2006, 5: 17.

[26]Sinha J, Plants BA, Inan M, et al. Causes of proteolytic degradation of secreted recombinant proteins produced in methylotrophic yeastPichia pastoris: case study with recombinant ovine interferon-tau. Biotechnol Bioeng, 2005, 89:102?112.

August 6, 2012; Accepted: December 11, 2012

Taicheng Zhu. Tel:+86-10-64807351; E-mail: zhutc@im.ac.cn

國家自然科學基金 (No. 31000026)，中國科學院“知識創(chuàng)新”工程重要方向項目 (No. KSCX2-EW-G-15-03) 資助。

Direct secretory expression of active microbial transglutaminase inPichia pastoris

Pengfei Li1, Hongbing Sun3, Lijin You3, Fuyu Gong3, Zao Chen4, Ailian Zhang2,and Taicheng Zhu3

1College of Life Science and Agriculture,Hainan University,Haikou570228,Hainan,China
2Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology,Ministry of Agriculture,Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou571101,Hainan,China
3Institute of Microbiology,China Academy of Sciences,Beijing100101,China
4College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen361005,Fujian,China

Direct secretory expression of active microbial transglutaminase (MTG) using heterologous hosts is a promising strategy, although its production level still needs to be improved for industrial production.Pichia pastorisis one of the most efficient expression systems developed in recent years. In this study, secretory expression of active MTG was successfully achieved by co-expressing the pro sequence and mature MTG genes inP. pastoris. Furthermore, we optimized the copy number of pro/MTG expression cassettes and the fermentation conditions. MTG production level reached 7.3 U/mL in 1-liter fermentor through high density fermentation, providing the feasiblity for industrial scale preparation of MTG.

microbial transglutaminase,Pichia pastoris, copy number, co-expression, high density fermentation, pro sequence

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31000026), Knowledge Innovation Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KSCX2-EW-G-15-03).

Ailian Zhang. Tel: +86-898-66989251; E-mail: zhangailian6@yahoo.com.cn

(本文責編 郝麗芳)