朱 琳，姜正林，何 鵬，施建生，馬東明，李建成，李永財，許世輝

(1 南通大學航海醫(yī)學研究所，江蘇南通 226001;2 南通大學附屬醫(yī)院;3 寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院)

三羥異黃酮(GST)屬異黃酮類植物雌激素。研究顯示，異黃酮類物質可減小腦梗死體積，提高存活的神經細胞數;通過減弱C-fos表達來阻止大腦中動脈閉塞(MCAO)誘導的計劃性細胞死亡;激活腦內的MAPK信號通路，從而發(fā)揮神經保護作用［1］。2012年3～9月，我們通過制備大鼠永久性大腦中動脈栓塞(pMCAO)模型，觀察GST對大鼠神經功能、腦梗死體積、神經干細胞數目、神經再生相關因子的影響，探討GST的神經保護作用及其對神經干細胞增生的影響機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 清潔級成年雄性SD大鼠170只，體質量260～280 g，由南通大學動物試驗中心提供。GST(Sigma公司)，神經生長因子(NGF)、神經細胞黏附分子(NCAM)、肌腱蛋白C(TN-C)、髓鞘相關生長抑制因子(Nogo-A)、膠質細胞來源的神經營養(yǎng)因子(GDNF)ELISA檢測試劑盒(上海繼錦化學科技有限公司)，兔抗 Nestin抗體(N5413，Sigma公司)，FITC標記的猴抗鼠IgG(Jackson)和FITC標記的山羊抗兔IgG(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 將大鼠分為假手術組、缺血對照組、GST治療組。采用線栓法制作pMCAO模型。將大鼠用10%水合氯醛麻醉，仰臥固定，沿頸部正中線切開，分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，結扎CCA近心端及ECA起始部，止血夾夾閉ICA，在CCA上作一小切口，將直徑0.18 mm的栓線從CCA插入ICA，直至有阻力為止，說明栓線穿過MCA起始段并達到大腦前動脈(ACA)近端。栓線插入深度距ECA分叉處(18.5±0.5)mm。結扎固定栓線，縫合皮膚。假手術組栓線只插入1 cm，其余步驟同模型組。動物蘇醒后對側肢體痛覺刺激缺失及運動障礙即為模型成功。

術后3 h開始腹腔注射用藥，神經行為學評分、尼氏染色觀察時GST治療劑量分為50、100 μg/kg;腦梗死體積測定、BrdU-Nestin免疫熒光雙標、ELISA 檢測時 GST 劑量為50 μg/kg，每24 h 1次，直到實驗終點。排除實驗過程中死亡的大鼠后，神經行為學評分四組各9只，尼氏染色四組各7只，腦梗死體積測定三組各9只，BrdU-Nestin免疫熒光雙標三組各8只，神經再生相關因子測定三組各6只。

1.2.2 神經行為學評分 于術前及術后1、2、3、4、5 d，參照改進的神經功能缺損癥狀評分(18分制)進行神經行為學評分。1～6分提示輕度損害，7～12分提示中度損害，13～18分提示嚴重損害。

1.2.3 腦梗死體積測量 術后72 h，大鼠深度麻醉后，迅速斷頭取腦，去除嗅球放入腦槽，-20℃冷凍10 min。從額極到枕極作2 mm厚連續(xù)額狀切片，將腦片放入1%TTC溶液中，37℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛緩沖液中固定，過夜。拍照并輸入計算機，用Image Pro Plus圖像處理軟件計算梗死面積。

1.2.4 神經細胞計數 將大鼠麻醉，350 mL生理鹽水快速心臟灌注后，繼續(xù)用4℃的4%多聚甲醛灌注，取腦，多聚甲醛固定，20%、30%的蔗糖梯度脫水，切片做尼氏染色，高倍鏡下分別計數前囟后1.70～2.30 mm缺血側海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、Cortex區(qū)完整的錐體細胞數目，每張切片計數3個區(qū)域，連續(xù)觀察7張腦片，取平均數。

1.2.5 免疫熒光檢測與細胞計數 大鼠術后第3、4、5天分別腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)溶液50 mg/kg，2次/d。于術后第6天灌注、取材、固定、脫水、切片，進行BrdU-Nestin免疫熒光雙標檢測，BrdU和Nestin共標的細胞為增生的神經干細胞。在缺血側海馬區(qū)的前、中、后部取3張腦片，免疫熒光顯色后，用熒光顯微鏡采集圖片，將雙標的圖片拼合，高倍鏡下計數皮質缺血損傷區(qū)周邊、海馬CA3和海馬CA1區(qū)重合的細胞數，取3張腦片的平均值作為該大鼠缺血側該區(qū)域的細胞數。

1.2.6 神經再生相關因子檢測 大鼠術后第5天斷頭取腦，組織勻漿，提取蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。采用大鼠ELISA試劑盒測定 NGF、NCAM、TN-C、GDNF、Nogo-A 濃度。取出板條復溫后，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫浴并徹底洗滌，底物TMB顯色，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度OD值，計算樣品濃度，然后再用樣品濃度除以總的蛋白濃度，得出單位總蛋白中所含樣品的量。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件，結果以表示，神經行為學評分采用秩和檢驗;其余數據采用單因素方差分析，兩兩比較用Scheffe法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GST對pMCAO大鼠神經功能缺損癥狀評分的影響 見表1。

2.2 GST對pMCAO大鼠腦梗死體積的影響 術后72 h TTC染色顯示，梗死區(qū)與右側MCA供血區(qū)一致。缺血對照組梗死體積為(29.80±1.64)%，GST 50 μg/kg治療組為(19.73 ±1.72)%，兩組比較有統計學差異(P＜0.01)。

表1 各組不同時間點神經功能缺損癥狀評分比較(分，)

表1 各組不同時間點神經功能缺損癥狀評分比較(分，)

注:與缺血對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n神經功能缺損癥狀評分第1天 第2天 第3天 第4天 第5天缺血對照組 9 8.333 ±0.558 8.333 ±0.615 7.833 ±0.703 8.000±0.000 7.667 ±0.211 GST治療組50 μg/kg 9 9.000 ±0.655 8.000 ±0.488 6.857 ±0.261 6.714 ±0.286＊＊ 5.286 ±0.421*100 μg/kg 9 7.667 ±0.441 7.222 ±0.494 6.556 ±0.444 6.000 ±0.408＊＊ 5.667 ±0.333＊＊

2.3 GST對pMCAO大鼠腦細胞形態(tài)和數目的影響 術后5 d腦組織尼氏染色顯示，假手術組海馬CA1、CA3區(qū)細胞層次清楚，細胞結構完整，胞質均勻，胞核圓大;皮質部神經元形態(tài)無明顯異常，細胞排列較緊密，胞核飽滿，核仁清晰。缺血對照組缺血側海馬CA1、CA3區(qū)細胞排列紊亂、形態(tài)不規(guī)則，細胞缺失，胞核固縮;缺血側皮質部著色明顯變淡，神經元縮小變形，核固縮。GST 50 μg/kg治療組和100 μg/kg治療組缺血側相應區(qū)域細胞排列較規(guī)整，形態(tài)基本正常，細胞略有丟失。各組海馬區(qū)錐體細胞計數比較見表2。

表2 各組海馬區(qū)椎體細胞計數比較(個/H，)

表2 各組海馬區(qū)椎體細胞計數比較(個/H，)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與低劑量組比較，△P＜0.01

＊＊假手術組 7 78.217 ±2.573＊＊ 67.191 ±2.380＊＊ 104.116 ±3.509缺血對照組 7 53.867 ±1.623 54.250 ±2.492 59.083 ±6.991 GST治療組50 μg/kg 7 69.583 ±0.773＊＊ 60.217 ±2.376* 85.716 ±2.281＊＊100 μg/kg 7 70.668 ±1.935＊＊ 68.945 ±0.925＊＊△102.723 ±1.303＊＊△

2.4 GST對pMCAO大鼠神經再生相關因子表達的影響 見表3。

表3 各組神經再生相關因子在腦組織中表達量的變化(ng/mL，)

表3 各組神經再生相關因子在腦組織中表達量的變化(ng/mL，)

注:與假手術組比較，*P ＜0.01;與缺血對照組比較，#P ＜0.01

組別 n GDNF NCAM NGF Nogo-A TN-C假手術組 6 215.900 ±24.132 1.293 ±0.082 15.628 ±1.637 0.339 ±0.047 25.651 ± 2.937缺血對照組 6 452.700 ±18.744* 5.993 ±0.742* 41.816 ±4.211* 0.782 ±0.047* 115.900 ±17.625*GST 治療組 6 571.500 ±42.673*# 10.023 ±1.475*# 63.095 ±6.453*# 1.078 ±0.117* 169.300 ±11.925*#

2.5 GST對神經干細胞增生的影響 大鼠pMCAO 5 d后，缺血對照組和GST治療組皮質損傷區(qū)周邊均有增生的神經干細胞，BrdU-Nestin陽性細胞計數分別為(15.210 ±1.270)、(22.500 ±0.430)個/HP。與缺血對照組的(1.000±0.200)個/HP 相比，GST 治療組增生的神經干細胞數目明顯增多(P＜0.01)。

3 討論

GST是從天然植物中提取的異黃酮類雌激素，具有與雌激素類似的作用，而無雌激素的嚴重不良反應。異黃酮類物質具有神經保護作用。慈春增等［2］發(fā)現，GST對腦缺血后卵巢去勢雌性大鼠有神經保護作用，可提高其學習記憶的能力。腦缺血后主要的損傷機制包括氧自由基、興奮性氨基酸的產生、細胞內鈣超載、炎癥反應和細胞凋亡。本研究發(fā)現，GST可減少大鼠pMCAO局灶性永久性腦梗死體積，改善神經行為學癥狀，減少缺血損傷后神經元的丟失，促進神經干細胞的增生，增加神經再生相關因子在腦組織中的表達，表明GST對大鼠永久性腦缺血損傷具有明顯的神經保護及促進神經干細胞增生的作用。其作用機制可能與擴張血管，增加腦血流量，改善腦缺血缺氧，清除氧自由基，減輕腦水腫，抑制炎癥反應，減少神經細胞凋亡有關［1，2］。本研究還發(fā)現，腦損傷后缺血灶周圍腦組織中的神經再生相關因子 NGF、NCAM、TN-C、Nogo-A、GDNF 表達增加，GST治療可進一步升高上述神經再生相關因子的表達量。

新生鼠缺氧缺血性腦損傷時，NGF和BDNF能減少神經細胞凋亡［3］，發(fā)揮神經保護作用。雄性新西蘭家兔MCAO 2、3、5 h后，NGF治療可顯著改善神經功能障礙，減少腦梗死體積、神經細胞凋亡及Caspase-3表達，上調Bcl-2表達［4］。由小干擾RNA(siRNA)引起的NCAM下調在小鼠MCAO模型中可導致腦梗死體積增大，顯著加劇神經元損害［5］。GDNF對缺血性腦損傷基于直接保護作用，局部應用可顯著減小MCAO大鼠的腦梗死體積、減輕腦水腫［6］。Nogo-A蛋白導入體外培養(yǎng)的大腦皮質神經元能拮抗由外源性H2O2引起的氧化應激［7］。提示GST對腦缺血大鼠的神經保護作用可能與上調上述因子的表達、營養(yǎng)與保護神經細胞、減輕神經細胞損傷有關。

NGF可與酪氨酸激酶受體TrkA、TrkB、TrkC和常見的神經營養(yǎng)因子受體p75NTR結合，調節(jié)神經元的存活、軸突生長、突觸重塑和神經傳導，還可調節(jié)生長錐和軸突中F-肌動蛋白的聚合和積累刺激軸突生長［8］。NCAM介導多種細胞—細胞間的相互作用，對神經系統發(fā)育的不同方面，包括細胞遷移、軸突生長和突觸的形成都有重要作用［9］。有研究顯示，Nogo-A參與繼發(fā)性軸索變性，下調Nogo-A的表達可減少軸索損傷、增強軸突再生，抑制Nogo-A可減少MCAO大鼠的丘腦神經元損傷［10］。GDNF通過糖基磷脂酰肌醇錨定的細胞表面受體、GDNF家族受體α1調節(jié)細胞活性，通過跨膜RET酪氨酸受體信號通路或神經細胞黏附分子促進細胞的存活、軸突生長和突觸形成［11］。脊髓損傷后，GDNF通過MEK-ERK信號通路作用增強軸突生長、突觸連接以及 GABA能神經遞質傳遞，改善功能障礙［12］。在體研究表明，TN-C可由參與髓鞘形成的施萬細胞合成，其沿生長錐伸展的路徑分布，有軸突誘導功能。胎鼠脊髓神經元缺氣損傷模型研究表明，TN-C可明顯促進神經元的活性及突起生長［13］。因此，GST通過增強上述神經再生相關因子的表達，促進神經元突起的生長、突觸重塑，改善神經功能缺損癥狀。

中樞神經系統中，不同的細胞因子在神經干細胞增生、遷移、分化，最終形成神經系統的各類細胞過程中具有重要作用。NCAM廣泛存在于中樞神經系統，在細胞增生、遷移、軸突生長和突觸重塑中有重要作用。NCAM和成纖維細胞生長因子受體相互作用，激活MAPK/ERK信號通路，從而誘導骨髓間充質干細胞的遷移和分化［14］。作為發(fā)育中神經組織細胞外基質的主要成分，TN-C與細胞增殖、遷移和形態(tài)相關。TN-C能促進少突膠質前體細胞的發(fā)育程序調節(jié)蛋白增殖及向髓鞘形成區(qū)域遷移［15］。GDNF對不同的外周神經元的存活、增殖和分化是必不可少的，在缺血缺氧新生大鼠模型中植入多能星形膠質干細胞，NGF、GDNF能促進干細胞的遷移和分化［16］。Nogo-A可調節(jié)體內的腦皮層神經元的遷移，敲小鼠敲除Nogo-A基因后，其前腦神經前體細胞的遷移會受到干擾。本研究發(fā)現，GST治療組BrdU-Nestin共標的神經干細胞數目明顯增多，表明GST可能通過刺激以上因子表達，誘導神經干細胞增生，繼而分化為具有功能的神經元，并遷移到相關功能區(qū)，促進損傷腦組織的修復與神經功能的恢復。

綜上所述，GST對缺血損傷腦組織具有保護作用，可促進缺血損傷后神經再生相關因子的表達和神經干細胞的增生，促進神經功能恢復，這為臨床應用GST治療缺血性卒中提供了實驗依據。

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