張麗梅，譚皓妍，徐韞健，李倩珺

(1 廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣州 510120;2 廣州市海珠區(qū)沙園街衛(wèi)生服務(wù)中心)

復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(RVVC)是指1年中發(fā)生4次或以上的外陰陰道念珠菌病，其發(fā)病率約占外陰陰道念珠菌病患者的5%［1］，是婦科常見癥、多發(fā)病，容易復(fù)發(fā)，難以根治。假絲酵母菌是常見條件致病菌，以白色假絲酵母菌多見。本研究通過基因測(cè)序，分析耐藥基因CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1和FLU1在假絲酵母菌株內(nèi)的表達(dá)，探討假絲酵母菌耐藥的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2011年6月在廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的RVVC患者58例，年齡20～52歲，均有典型的豆渣樣白帶和外陰瘙癢等癥狀，白帶常規(guī)鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲或孢子，每年復(fù)發(fā)4次以上。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本分離與鑒定 取患者的白帶標(biāo)本，常規(guī)接種于沙氏平板培養(yǎng)24 h，取直徑0.5～1.5 mm、光滑、凸起、濕潤的小白菌落涂片鏡檢。如為假絲酵母菌，取菌落接種在科瑪嘉(CHROMagar)念珠菌顯色平板上，35℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。不能鑒定的用Vitek-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定。質(zhì)控菌株ATCC64548、ATCC45550購自衛(wèi)生部藥物鑒定所。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 將已鑒定的假絲酵母菌、質(zhì)控菌株ATCC64548和ATCC45550分別用生理鹽水配制成0.25麥?zhǔn)媳葷釕乙?，均勻涂布于真菌藥敏平板上。藥敏紙片選用5-氟胞嘧啶(5-Fu)、兩性霉素B(AMP)、氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)、咪康唑(MIC)。35℃孵育24 h，量取藥敏環(huán)直徑，5-Fu＞20 mm、AMP＞15 mm、FCA＞22 mm、ITR ＞16 mm、MIC＞20 mm判斷為敏感;5-Fu＜11 mm、AMP＜10 mm、FCA ＜14 mm、ITR＜9 mm、MIC＜12 mm判斷為耐藥。

1.2.3 酵母菌DNA的抽提 收集58株假絲酵母菌，接種于沙保羅平板，35℃培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落接種到沙保羅肉湯，35℃培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液置于1.5 mL EP管中，離心去上清，向沉淀中加入500 μL的Solution A，輕微振蕩并充分懸浮沉淀，于37℃溫浴1 h，加入100 μL的Solution B，輕微振蕩混勻后于70℃溫浴10 min，加入200 μL的Solution C，輕微振蕩混勻后，冰上冷卻5 min，4℃離心5 min，將上清移入新的1.5 mL的EP管中。加入上清液1/2體積的異丙醇，充分混勻，4℃離心5 min，棄上清，向沉淀中加入500 μL預(yù)冷的70%乙醇，洗滌沉淀，4℃離心5 min，棄上清，保留DNA沉淀室溫干燥，加入適量TE Buffer溶解基因組DNA。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 根據(jù) Genbank中假絲酵母菌CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1 和 FLU1 基因序列設(shè)計(jì)引物，引物由上海英俊生物公司合成。見表1。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 20 μL，上下游引物各 1 μL，10 × PCR 緩沖液2 μL，150 μL/L dNTP 1 μL，Taq 酶0.25 μL，ddH2O 12.75 μL，DNA 模板 2 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，95℃ 35 s，58 ℃ 35 s，72 ℃50 s，共循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.2%瓊脂糖凝膠(加EB)電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行查詢比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 假絲酵母菌鑒定結(jié)果 臨床分離假絲酵母菌58株，其中白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、乳酒假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌分別為45(77.6%)、3(5.1%)、1(1.7%)、8(13.8%)、1 株(1.7%)。主要致病菌為白假絲酵母菌 45株(77.6%);非白假絲酵母菌中，光滑假絲酵母菌致病率最高，為13.8%。

2.2 假絲酵母菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 用聚合酶鏈反應(yīng)PCR擴(kuò)增耐藥基因組CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1和 FLU1，陽性率分別為62.1%(36/58)、60.3%(35/58)、56.9%(33/58)、62.1%(36/58)和0。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后進(jìn)行分析，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行查詢比對(duì)，與已在美國生物信息中心登錄的CDR1、CDR2、ERG11和CaMDR1基因序列分別為 100%、98.0%、99.0%、99.0% 相同。

表1 PCR引物情況表

2.3 假絲酵母菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析 5-Fu和MIC的耐藥率較高，并出現(xiàn)多重耐藥情況，AMP和FCA的耐藥率較低。見表2。58株假絲酵母菌中有3例對(duì)FCA耐藥，其中白假絲酵母菌1例，光滑假絲酵母菌2例。

表2 假絲酵母菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

RVVC容易復(fù)發(fā)，難以根治。RVVC患者中，由假絲酵母菌屬中的白假絲酵母菌引起的感染占大多數(shù)，非白假絲酵母菌如熱帶假絲酵母菌、乳酒假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌等也占有相當(dāng)比例，文獻(xiàn)報(bào)道為 20% ～30%［2］。Richter等［3］對(duì)84例RVVC患者陰道分泌物的培養(yǎng)結(jié)果顯示，非白假絲酵母菌為42%，而同期收集的 VVC患者為20%。由于非白假絲酵母菌與白假絲酵母菌在對(duì)黏膜的黏附性強(qiáng)弱、分泌型蛋白酶的產(chǎn)生及藥物敏感性方面均有很大差異，因此增加了其治療難度。張洪文等［4］報(bào)道，RVVC非白假絲酵母菌感染高于VVC，兩者非白假絲酵母菌感染中均以光滑假絲酵母菌為主。張雨華等［5］報(bào)道，深圳地區(qū)RVVC主要致病菌為白假絲酵母菌(占71.8%)，非白假絲酵母菌中光滑假絲酵母菌致病率最高(占11.8%)。本研究中，RVVC患者白帶標(biāo)本致病菌為白假絲酵母菌(占77.6%)，非白假絲酵母菌中光滑假絲酵母菌致病率最高(13.8%)，與文獻(xiàn)報(bào)道相近，表明白假絲酵母菌是RVVC的主要致病菌。

目前，治療假絲酵母菌感染的藥物主要有唑類(如FCA)、多烯類(如AMP)、棘球白素類(如卡泊芬凈)和嘧啶類(如5-Fu)。其中FCA具有水溶性、口服生物利用度高(可達(dá)90%以上)、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，是最常用的抗真菌藥。本研究58株假絲酵母菌中，5-Fu和MIC的耐藥率較高，分別為10.3%和17.2%;AMP和 FCA的耐藥率較低，分別為3.4%和5.2%;其中對(duì)FCA耐藥3例(1例為白假絲酵母菌，2例為光滑假絲酵母菌)。由于FCA的廣泛和長(zhǎng)期使用，近10年來臨床上約有90%的菌株有不同程度的耐藥性，且具有交叉耐藥性，逐漸占酵母樣真菌耐藥的首位，是導(dǎo)致RVVC臨床治療失敗的主要原因。

假絲酵母菌耐藥是近年研究的熱點(diǎn)。唑類耐藥的主要原因包括麥角固醇合成通路的改變和細(xì)胞膜多藥耐藥蛋白的高表達(dá)。在細(xì)胞整體水平上，物質(zhì)代謝通路的改變必然對(duì)應(yīng)著基因水平上參與此物質(zhì)代謝相關(guān)基因的改變，ERG11、ERG5等麥角固醇合成通路中關(guān)鍵基因的過表達(dá)或突變，引起多種代謝通路的變化。另外，假絲酵母菌耐藥為編碼外排泵ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的基因CDR1、CDR2和編碼主要易化擴(kuò)散載體超家族的基因MDR1和FLU1的過表達(dá)，而藥物外排能力的增強(qiáng)導(dǎo)致胞內(nèi)藥物濃度降低，可能是白色念珠菌最主要的耐藥機(jī)制［6，7］。本研究結(jié)果顯示，假絲酵母菌耐藥基因組CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1和FLU1在RVVC患者中的陽性率分別為 62.1%、60.3%、56.9%、62.1% 和 0。CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1 在敏感和耐藥的白假絲酵母菌中均能檢測(cè)到，與文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致。提示白假絲酵母菌無論是耐藥還是敏感，都存在CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1 的表達(dá)，都有可能出現(xiàn)對(duì)抗真菌藥物的耐藥現(xiàn)象，但耐藥基因的產(chǎn)生并不代表假絲酵母菌耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，耐藥現(xiàn)象是在多種機(jī)制共同作用下逐漸形成的，CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1和FLU1的表達(dá)量與菌株耐藥性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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