劉國巖，徐展望，徐琬梨

(1 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南 250014;2 山東中醫(yī)藥大學)

中藥骨碎補具有治療骨質(zhì)疏松癥和促進骨折愈合的功效。目前，關于骨碎補治療機制的研究多集中在促成骨方面，核心結合因子α1(Cbfα1)是促進骨發(fā)育和骨形成的重要因子［1］，其表達量決定了骨重建的方向。2012年3～9月，我們采用細胞生物學和藥理學方法，用骨碎補提取液培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，檢測BMSCs中Ⅰ型膠原及Cbfα1的表達，探討骨碎補在BMSCs向成骨分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 4～6周齡SD大鼠30只，雌雄不限(山東大學實驗動物中心)。RPMI1640培養(yǎng)基(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，胎牛血清(Gibco公司)，F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液(上海麥倉生物科技有限公司)，中藥骨碎補(山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房)，胰蛋白酶及 L-谷氨酰胺(Sigma)。CO2培養(yǎng)箱(美國 F.S)，電子分析天平(德國賽多利斯 ME235P)，圖像分析系統(tǒng)(美國 Image-Pro Plus)，倒置相差顯微鏡(美國 AO)。

1.2 方法

1.2.1 骨碎補的提取與溶液配制 取骨碎補600 g，加入10倍量70%乙醇回流提取2次，每次2 h。2次提取液合并后減壓回收乙醇，將提取液濃縮至300 mL，相當于每mL含藥材2 g，4℃冰箱保存。標準培養(yǎng)液(作為基礎培養(yǎng)液和標準對照組培養(yǎng)液):RPMI 1640(含15%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL);含骨碎補醇提物培養(yǎng)液(作為實驗組培養(yǎng)液):在標準培養(yǎng)液中加入骨碎補醇提物，分別形成終濃度為20、2、0.2 mg/mL的培養(yǎng)液。

1.2.2 大鼠BMSCs取材、原代與傳代培養(yǎng) 稱取大鼠體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉腹腔注射處死，75%乙醇浸泡消毒后，無菌條件下分離雙側股骨，置入加有雙抗液的PBS中浸泡5 min;剪去骺端，用無菌注射器吸取DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集沖洗液混勻后，按1∶1的比例緩慢疊加在淋巴細胞分離液上，離心收集中間白霧層，以獲取單核細胞，再用PBS沖洗2次，加入配置好的培養(yǎng)基，以2×10-6/mL接種于一次性培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后重新更換培養(yǎng)液，然后每3 d更換培養(yǎng)液1次。當細胞成長并逐漸融合到80%時，用0.25%胰酶消化傳代。按1∶2比例接種于新的培養(yǎng)瓶進行第一次傳代，倒置相差顯微鏡下逐日觀察。同樣方法進行傳代后的下代細胞培養(yǎng)。

1.2.3 實驗分組 將細胞分為5組:標準培養(yǎng)基組(無血清培養(yǎng)基);條件培養(yǎng)基組(地塞米松1×10-8mol/L、β-甘油磷酸鈉 10 mmol/L、VitC 50 μg/mL);中藥1組(骨碎補提取液20 mg/mL);中藥2組(骨碎補提取液2 mg/mL);中藥3組(骨碎補提取液0.2 mg/mL)。均于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 免疫組化染色檢測Ⅰ型膠原含量 傳代細胞培養(yǎng)后7 d采用SP染色法光鏡下觀察，棕黃色即為陽性染色。每組取6個標本，各組每一染色標本在40倍物鏡下隨機選取5個視野，每一視野用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測量染色區(qū)域的總面積值和平均光密度值，然后求其乘積，5個視野的平均值代表這一染色標本的染色陽性均值。

1.2.5 RT-PCR方法檢測 Cbfα1表達 采用 Trizol法提取總RNA，進行RNA濃度、純度和完整性測定。分光光度計測定RNA濃度后進行RT反應及PCR擴增。Cbfα1上游引物:5'-GGTGGTCTGAGCTGGGATAC-3'，下 游 引 物:5'-TAGGGTCAATGACACGACCA-3'，擴增條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火1 min，共循環(huán)30次，最后72℃延伸1 min。β-action作為內(nèi)參，上游引物:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，下游引物:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。擴增條件:94℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個循環(huán);72℃延伸5 min。在骨碎補提取液培養(yǎng)BMSCs第7天時取RT-PCR產(chǎn)物5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結果，以Cbfα1的DNA條帶和β-action的DNA條帶灰度值比計算產(chǎn)物相對表達水平。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，統(tǒng)計數(shù)據(jù)分別進行方差齊性檢驗后進行方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察結果 原代培養(yǎng)接種12 h即有細胞開始貼壁，多數(shù)以分散、克隆集落方式增殖;24 h更換培養(yǎng)液后已有大量細胞貼壁，貼壁細胞均勻、飽滿、透亮，大部分呈圓形;3～5 d時可見細胞呈典型的集落樣生長，集落之間相互靠近;5～7 d時相鄰集落融合成片達80%，細胞間界限不清，細胞呈長梭形。傳代后生長旺盛，可見明顯的分裂增殖，長梭形均勻分布，后期呈漩渦狀排列。

2.2 各組Ⅰ型膠原含量、Cbfα1表達比較 染色7 d后標準培養(yǎng)基組及條件培養(yǎng)基組陽性Ⅰ型膠原免疫組化染色較少，顯著低于各中藥組(P均﹤0.01)，中藥 2組顯著高于中藥 1、3組(P均﹤0.05)。標準培養(yǎng)基組、條件培養(yǎng)基組Cbfα1的RTPCR檢測條帶灰度均低于各中藥組，中藥2組明顯高于中藥1、3組。見表1。

3 討論

BMSCs是一種具有多向分化潛能的細胞，在特定的誘導條件下，可分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉等多種中胚層細胞。從骨髓分離的間充質(zhì)細胞是誘導分化為成骨細胞的優(yōu)良來源［2，3］，誘導條件是促進BMSCs成骨分化及提高BMSCs成骨能力的重要影響因素。近年研究證實，中藥可調(diào)控BMSCs向成骨細胞的定向分化。中藥骨碎補為水龍科多年生蕨類植物槲蕨的干燥根莖，味苦、溫，歸腎、肝經(jīng)，功效補腎強骨、續(xù)傷止痛，為骨傷科常用藥物［4］。體外細胞培養(yǎng)證明，骨碎補能促進成骨細胞的活性和增殖，增加骨形成，提高骨密度，維持骨微結構的完整程度［5］。

表1 各組Ⅰ型膠原、Cbfα1表達比較()

表1 各組Ⅰ型膠原、Cbfα1表達比較()

注:與標準培養(yǎng)基組和條件培養(yǎng)基組比較，*P＜0.01;與中藥2組比較，△P ＜0.05

組別 n 免疫組化染色陽性均值 Cbfα1/β-action標準培養(yǎng)基組6 0.2324 ±0.012 1.007 ±0.032條件培養(yǎng)基組 6 0.3422 ±0.024 1.081 ±0.027中藥1 組 6 0.4874 ±0.014＊△ 1.144 ±0.019＊△中藥2 組 6 0.5382 ±0.009* 1.384 ±0.029*中藥3 組 6 0.4356 ±0.017＊△ 1.115 ±0.031＊△

Cbfα1是成骨細胞的特異性轉錄因子，其不僅促進成骨細胞分化，還影響分化后成熟成骨細胞的功能，在成骨細胞系中呈高表達，是在促成骨細胞分化中起關鍵作用的轉錄因子，對于成骨細胞分化具有重要意義。Cbfα1也可促進Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶、骨橋素等多個表型基因的表達［6，7］，反映成骨細胞分化的活躍程度。另外，Cbfα1還能促進骨的礦化，通過調(diào)節(jié)骨骼硬化基因來平衡成骨細胞的分化及功能;通過調(diào)節(jié)BMSCs的功能來促進骨形成［8］。Feng等［9］報道，3 月齡大鼠骨髓細胞中 Cbfα1 mRNA表達水平最高，是1月齡的3倍，表明該階段骨髓細胞向成骨細胞分化加速，以適應骨骼快速生長的需求。Komori等［6］發(fā)現(xiàn)，Cbfα1基因敲除雜合子小鼠出生時其骨組織發(fā)育明顯受阻，而Cbfα1基因敲除純合子小鼠出生時則無成骨細胞和骨組織形成;Cbfα1基因反義寡核苷酸則能阻止成骨細胞分化和骨化形成。提示Cbfα1基因與成骨細胞發(fā)育、分化和骨形成過程密切相關。

目前，中藥調(diào)控對BMSCs促成骨的作用研究主要圍繞著對堿性磷酸酶及Ⅰ型膠原表達的影響。本實驗通過觀察骨碎補培養(yǎng)BMSCs促成骨分化的Ⅰ型膠原表達和RT-PCR檢測Cbfα1的表達變化，探討骨碎補對Cbfα1表達的影響。結果表明，各濃度骨碎補提取液對BMSCs具有促進其向成骨分化和促進Cbfα1表達的作用，各中藥組培養(yǎng)組細胞不僅在形態(tài)結構上、體外培養(yǎng)特性上優(yōu)于標準培養(yǎng)基組及條件培養(yǎng)基組，且有較滿意的Ⅰ型膠原免疫組化染色陽性率和Cbfα1轉錄率。其中2 mg/mL骨碎補提取液具有明顯促大鼠BMSCs成骨分化及加強Cbfα1表達的作用。但以往研究對不同濃度骨碎補提取液促進BMSCs增殖分化的報道存在差異，2 mg/mL作為實驗中的中等濃度只是相對計量，具體骨碎補提取液與促進BMSCs向成骨分化存在怎樣一個最佳量效關系，還有待進一步研究。骨碎補的主要活性物質(zhì)為柚皮甙，此外還有甲基丁香酚、β-2谷甾醇、原兒茶酸、新北美圣草甙、骨碎雙氫黃酮甙等多種化學物質(zhì)。骨碎補中誘導BMSCs成骨分化及促進Cbfα1表達的具體化學成分有待進一步證實。

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