徐 瑲，杜 剛，艾 青，蘭 歡

(1 瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000;2 重慶醫(yī)科大學(xué))

FAM64A基因又名CATS，最早是在檢測(cè)與網(wǎng)格蛋白組裝淋巴髓系白血病基因(CALM)相互作用的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)［1］。其在胸腺、脾和結(jié)腸組織中高表達(dá)，cDNA全長(zhǎng)1517 bp，編碼含238和248個(gè)氨基酸的兩種異構(gòu)體，蛋白分子量分別為26、27.5 kD。FAM64A蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，其表達(dá)可顯著增加CALM基因和致白血病的CALM/AF10融合蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的定位。

目前，關(guān)于FAM64A基因生物學(xué)功能的報(bào)道在國(guó)內(nèi)外還非常少，僅有2篇，即FAM64A蛋白可能參與細(xì)胞的增殖過(guò)程［2］，以及可作為(APC/C分裂后期促進(jìn)復(fù)合體)的作用底物促進(jìn)細(xì)胞分裂由中期向后期轉(zhuǎn)變［3］。但是，目前關(guān)于FAM64A在腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控等方面的作用尚不清楚。為進(jìn)一步探討FAM64A在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能以及其作為分子靶點(diǎn)用于腫瘤治療的潛在價(jià)值，2012年11月～2013年3月，本研究觀察了FAM64A在細(xì)胞周期中的表達(dá)變化、對(duì)化療藥物的敏感性，并通過(guò)siRNA抑制FAM64A的表達(dá)，觀察其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌HeLa細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS)和青霉素(100 IU/mL)/鏈霉素(100 IU/mL)，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM、FBS、Lipofectamine RNAiMAX、Trizol購(gòu)于Invitrogen公司;PrimeScriptRT Reagent Kit購(gòu)于 TaKaRa公司;阿霉素(ADR)、胸腺嘧啶脫氧核苷、諾考達(dá)唑和碘化乙啶購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞DNA損傷模型制備 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，以10×105/mL接種至10 cm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿(密度約為100%);置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入ADR至終濃度1 μmol/L;根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求在加藥后0～48 h收集細(xì)胞，制備細(xì)胞總RNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 M 期同步化 參照 Knehr等［4］和 Whitfield等［5］的方法，采用胸腺嘧啶脫氧核苷/諾考達(dá)唑阻斷法，進(jìn)行細(xì)胞M期同步化。具體實(shí)驗(yàn)程序略述如下:收集處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，以5×105/mL接種至10 cm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿。24 h后換用含2 mmol/L雙重胸腺嘧啶脫氧核苷的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)17～18 h。PBS洗滌3次，換用正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h。換用含100 ng/mL諾考達(dá)唑的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，此時(shí)約有90%的細(xì)胞被阻滯在M期。收集包括漂浮細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞，PBS洗滌2次，換用正常DMEM培養(yǎng)基重新接種于10 cm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿，此時(shí)細(xì)胞周期阻滯得以釋放，細(xì)胞將依次進(jìn)入 G1、S、G2、M 期。在釋放后 0、4、8、12、16、18 h收集細(xì)胞，分別制備單細(xì)胞懸液和總RNA樣品，進(jìn)行FACS、RT-PCR分析。

1.2.3 siRNA的設(shè)計(jì)、合成和篩選 以 GeneBank公布的FAM64A mRNA序列為模板，通過(guò)Dharmacon公司的軟件在線設(shè)計(jì)FAM64A的短鏈干擾siRNA。一共設(shè)計(jì)3種候選序列，并設(shè)立1個(gè)陰性對(duì)照siRNA，委托上海GenePharma公司進(jìn)行體外化學(xué)合成。獲得FAM64A的短鏈干擾siRNA后，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，分別制備細(xì)胞裂解液和總RNA，采用半定量RT-PCR方法篩選確認(rèn)高效的PRR11 siRNA。

1.2.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 短鏈 siRNA轉(zhuǎn)染采用 Lipofectamine RNAiMAX試劑進(jìn)行。以6孔板為例，每孔中加入500 μL opti-MEMⅠ和30 pmol siRNA，混合后再加入5 μL RNAiMAX，混勻后室溫放置20 min。此時(shí)以不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)(10～40)×104/mL。每孔中加入2.5 mL細(xì)胞懸液，與 siRNA混合液混合后，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h。轉(zhuǎn)染后48～72 h收集細(xì)胞，制備總RNA后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.5 FAM64A表達(dá)水平檢測(cè) 采用常規(guī)半定量RT-PCR方法。收集正常傳代生長(zhǎng)和處理后的HeLa細(xì)胞，參照Invitrogen公司Trizol使用說(shuō)明書提取細(xì)胞總 RNA。取 1 μg 總 RNA，加入 1 μL 50 μmol/L隨機(jī)引物、1 μL 10 mmol/L dNTP Mixture，DEPC 水補(bǔ)足至10 μL，65℃溫育5 min，冰上冷卻后依次加入 4.5 μL DEPC 水、4 μL 5 × PrimeScriptTMBuffer、0.5 μL 40 U/μL RNase Inhibitor 和 1 μL Prime-ScriptTMRTase，30℃ 溫育 10 min，42℃ 溫育 60 min，70℃ 15 min終止反應(yīng)，cDNA產(chǎn)物原液稀釋20倍后用作PCR模板。GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:1 μL 10 × PCR buffer、1 μL 2.5 mmol/L dNTPs、20 × cDNA 模板1 μL、0.1 μL Taq 酶(5 U/μL)、0.4 μL 10 μmol/L 上下游引物混合液，雙蒸水補(bǔ)足至10 μL。擴(kuò)增程序:95℃變性2 min，然后用逐步程序95℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 20 s完成19～35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.6 細(xì)胞周期分析 收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入1 mL無(wú)水乙醇混懸細(xì)胞，4℃放置4 h以上或過(guò)夜。低速離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入500 μL FACS緩沖液(PBS+0.1%BSA+0.01%NaN3)混懸細(xì)胞。再加入 2.5 μL 10 mg/mL 的 RNase，室溫放置 15 min。然后加入25 μL 1 mg/mL的碘化丙啶(PI)，室溫避光放置15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA損傷后FAM64A表達(dá)水平變化 ADR作用細(xì)胞 0、3、6、12、24、48 h 時(shí)，RT-PCR 檢測(cè)FAM64A基因灰度值分別為 6.78±0.57、2.48±0.31、2.50 ±0.38、1.72 ±0.17、0.78 ±0.09、0.41 ±0.05;3、6、12、24、48 h 時(shí)點(diǎn)與 0 時(shí)點(diǎn)比較，P 均 ＜0.05。見圖1。

圖1 ADR作用不同時(shí)間點(diǎn)的HeLa細(xì)胞FAM64A基因電泳圖

2.2 M期細(xì)胞同步化分析結(jié)果 在細(xì)胞同步化后，采用細(xì)胞流式分析不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞周期分布情況，約90%的HeLa細(xì)胞被阻滯在M期，釋放后的細(xì)胞依次同步進(jìn)入 G1、S、G2、M 期，并回到 G1期，證實(shí)同步化處理成功。見表1。

表1 同步化細(xì)胞釋放后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期分部情況(%)

2.3 同步化細(xì)胞釋放后FAM64A表達(dá)水平變化同期化細(xì)胞釋放后 0、4、8、12、16、18 h，RT-PCR 檢測(cè) FAM64A 基因灰度值分別為 0.72 ±0.18、0.45 ±0.11、0.64 ±0.14、0.52 ±0.11、0.94 ±0.22、0.54 ±0.13;4、12、16 h 時(shí)點(diǎn)與 0 時(shí)點(diǎn)比較，P 均 ＜0.05。見圖2。

圖2 同步化細(xì)胞釋放后不同時(shí)間點(diǎn)FAM64A基因電泳圖

2.4 FAM64A siRNA對(duì)FAM64A表達(dá)的影響 本研究共合成了3個(gè)針對(duì)FAM64A mRNA編碼區(qū)不同靶點(diǎn)的 siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，同時(shí)設(shè)置siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)照組。對(duì)照組、siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組轉(zhuǎn)染后48 h FAM64A基因表達(dá)灰度值分別為1.19 ±0.18、0.55 ±0.09、0.57 ±0.11、0.77±0.17;siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組與對(duì)照組比較，P均 ＜0.05。結(jié)果顯示，siRNA1抑制FAM64A表達(dá)的效果最好，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染48 h后FAM64A基因電泳圖

2.5 FAM64A表達(dá)抑制對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響在轉(zhuǎn)染FAM64A siRNA1后48 h，使用流式細(xì)胞術(shù)分析FAM64A表達(dá)抑制對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響，結(jié)果見表2。

表2 FAM64A表達(dá)抑制對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響(%)

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素作用、多基因參與、經(jīng)過(guò)多個(gè)階段才最終形成的極其復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，其中癌基因和抑癌基因表達(dá)失調(diào)，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)失控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［6，7］。FAM64A 基因是新近發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞周期調(diào)控的基因，可能與細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖以及腫瘤的發(fā)生有關(guān)。因此，開展FAM64A基因在腫瘤細(xì)胞中的周期調(diào)控及其對(duì)細(xì)胞周期等的影響的研究，對(duì)于闡明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，在ADR處理HeLa細(xì)胞構(gòu)建的細(xì)胞損傷模型中，F(xiàn)AM64A的表達(dá)量隨著時(shí)間進(jìn)程顯著降低。ADR是一種化療藥物，可阻斷DNA和RNA的合成［8，9］，并通過(guò)刺激內(nèi)源性 p53、p21WAF1/CIP1和Bcl-2家族的表達(dá)增加而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。本研究結(jié)果提示，F(xiàn)AM64A參與了細(xì)胞損傷的應(yīng)答過(guò)程，其作用機(jī)制可能是在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中參與DNA的合成，也可能通過(guò)增加細(xì)胞的抗凋亡活性從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

細(xì)胞周期是由多個(gè)正性和負(fù)性調(diào)節(jié)因子有序而嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程，原癌基因和抑癌基因產(chǎn)物直接或間接參與周期內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，從而對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)控，任何一種調(diào)節(jié)步驟的失調(diào)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖的紊亂繼而引起癌癥的發(fā)生［11］。在細(xì)胞周期表達(dá)譜分析中我們也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM64A是一個(gè)G2/M期基因，它和已知的G2/M期基因Plk1一樣，在G2/M期表達(dá)水平升高，而在 G1、S期表達(dá)降低［12，13］，提示 FAM64A 是一個(gè)參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的癌基因。Zhao等［3］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM64A擴(kuò)散性地分布于有絲分裂細(xì)胞，而不與染色體、著絲粒、紡錘體和中心體相互結(jié)合，提示FAM64A在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用而參與細(xì)胞周期調(diào)控。此外，雖然FAM64A可推動(dòng)有絲分裂中期向后期轉(zhuǎn)變，但它并不影響G2/M期檢測(cè)點(diǎn)蛋白的水平，抑制其表達(dá)也不引起檢測(cè)點(diǎn)的偏移。本研究也發(fā)現(xiàn)，siRNA誘導(dǎo)的FAM64A表達(dá)沉默可誘發(fā)HeLa細(xì)胞的S期停滯，而未出現(xiàn)如Plk1一樣的G2/M期停滯［14，15］。 由 此 提 示，F(xiàn)AM64A可能與S期相關(guān)蛋白相互作用而在細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮作用。在未來(lái)的工作中，還需要大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)探討FAM64A在細(xì)胞周期調(diào)控中的相互作用蛋白及具體作用機(jī)制，從而進(jìn)一步闡明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制和功能。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM64A能增加細(xì)胞的抗凋亡活性并參與細(xì)胞周期的調(diào)控，它可能是一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究FAM64A在腫瘤中的作用奠定基礎(chǔ)。

［1］Archangelo LF，Gl?sner J，Krause A，et al.The novel CALM interactor CATS influences the subcellular localization of the leukemogenic fusion protein CALM/AF10［J］.Oncogene，2006，25(29):4099-4109.

［2］Archangelo LF，Greif PA，H?lzel M，et al.The CALM and CALM/AF10 interactor CATS is a marker for proliferation［J］.Mol Oncol，2008，2(4):356-367.

［3］Zhao WM，Coppinger JA，Seki A，et al.RCS1，a substrate of APC/C，controls the metaphase to anaphase transition［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(36):13415-13420.

［4］Knehr MB，Poppe M，Enulescu M，et al.A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in special cell cycle phase［J］.Exp Cell Res，1995，217(2):546-553.

［5］Whitefield ML，Sherlock G，Saldanha AJ，et al.Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors［J］.Mol Bio Cell，2002，13(6):1977-2000.

［6］Hanahan D，Weinberg RA.The hallmarks of cancer［J］.Cell，2000，100(1):57-70.

［7］Dang LH，Bettegowda C，Agrawal N，et al.Targeting vascular and avascular compartments of tumors with C.novyi-NT and anti-microtubule agents［J］.Cancer Biol Ther，2004，3(3):326-337.

［8］Momparler RL，Karon M，Siegel SE，et al.Effect of adriamycin on DNA，RNA，and protein synthesis in cell-free systems and intact cells［J］.Cancer Res，1976，36(8):2891-2895.

［9］Pigram WJ，F(xiàn)uller W，Hamilton LD.Stereochemistry of intercalation:interaction of daunomycin with DNA［J］.Nature New Biol，1972，235(53):17-19.

［10］Bilim VN，Tomita Y，Kawasaki T，et al.Adriamycin(ADM)induced apoptosis in transitional cell cancer(TCC)cell lines accompanied by p21 WAF1/CIP1 induction［J］.Apoptosis，1997，2(2):207-213.

［11］Orlando DA，Lin CY，Bernard A，et al.Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators［J］.Nature，2008，453(7191):944-947.

［12］Hamanaka R，Smith MR，O'Connor PM，et al.Polo-like kinase is a cell cycle-regulated kinase activated during mitosis［J］.J Biol Chem，1995，270(36):21086-21091.

［13］Lee KS，Yuan YL，Kuriyama R，et al.Plk is an M-phase-specific protein kinase and interacts with a kinesin-like protein，CHO1/MKLP-1［J］.Mol Cell Biol，1995，15(12):7143-7151.

［14］Reagan-Shaw S，Ahmad N.Silencing of polo-like kinase(Plk)1 via siRNA causes induction of apoptosis and impairment of mitosis machinery in human prostate cancer cells:implications for the treatment of prostate cancer［J］.FASEB J，2005，19(6):611-613.

［15］Lan H，Zhu J，Bu Y，et al.Rapid functional screening of effective siRNAs against Plk1 and its growth inhibitory effects in laryngeal carcinoma cells［J］.BMB Rep，2010，43(12):818-823.