李海濤，李玉明

(首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300)

鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，為Ser/Thr蛋白激酶CaMKS家族中多功能酶成員，廣泛分布于神經(jīng)組織，參與調(diào)節(jié)突觸傳遞過程，形成長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)，是介導(dǎo)學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵物質(zhì)。此外，CaMKⅡ還具有調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄等多種功能。腦缺血損傷的機(jī)制復(fù)雜，涉及興奮性氨基酸毒作用、鈣離子超載及氧化應(yīng)激生成自由基等因素。在腦缺血損傷的病理過程中，CaMKⅡ起著極為關(guān)鍵的作用。本文對(duì)CaMKⅡ在神經(jīng)缺血性損傷中的作用進(jìn)行綜述。

1 CaMKⅡ生物特性

CaMKⅡ是一種多功能蛋白激酶，在海馬和皮層中表達(dá)較高，約占海馬總蛋白的2%;神經(jīng)元的胞體和樹突中CaMKⅡ含量最高，其次是神經(jīng)末梢。電鏡下發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡ主要定位于漿膜、線粒體和突觸后顆粒(PSD)。CaMKⅡ分子由 α、β、γ、δ 4種亞單位構(gòu)成，每種亞單位均有單獨(dú)的基因編碼。序列分析顯示，CaMKⅡ分子中包含有1個(gè)位于N末端的接觸催化區(qū)、1個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)、1個(gè)可變序列和1個(gè)位于C末端的亞基偶聯(lián)區(qū)。其中調(diào)節(jié)區(qū)又由自身抑制域、鈣調(diào)素結(jié)合域和自身磷酸化位點(diǎn)組成。當(dāng)Ca2+/CaM缺乏時(shí)，CaMKⅡ調(diào)節(jié)區(qū)的自身抑制域和催化區(qū)相結(jié)合，從而阻止了底物蛋白和催化區(qū)結(jié)合，CaMKⅡ處于非激活狀態(tài);當(dāng)Ca2+/CaM復(fù)合物形成時(shí)，其作用到CaMKⅡ結(jié)合區(qū)，使CaMKⅡ分子構(gòu)象發(fā)生改變，使鄰近亞基的結(jié)構(gòu)域發(fā)生T286磷酸化，自身抑制區(qū)失活，CaMKⅡ被活化，這一過程為Ca2+依賴性磷酸化;與此同時(shí)，T286磷酸化進(jìn)一步催化酶自身磷酸化位點(diǎn)(T305/306)磷酸化，因而當(dāng)Ca2+缺乏時(shí)，催化區(qū)處于持久活化狀態(tài)，催化底物磷酸化，酶的這種不依賴Ca2+的自身磷酸化激活稱為自身磷酸化。具備兩種激活方式是CaMKⅡ的獨(dú)特特征［1］，其中自身磷酸化涉及細(xì)胞損傷機(jī)制［2］。

2 CaMKⅡ與缺血性神經(jīng)損傷

2.1 神經(jīng)缺血損傷過程中CaMKⅡ活性變化 在生理情況下，腦組織中CaMKⅡ水平低，但足以維持細(xì)胞內(nèi)正常生化反應(yīng)需要和正常的突觸信息傳遞。短暫腦缺血激活CaMKⅡ，表現(xiàn)為CaMKⅡ磷酸化水平升高，急性嚴(yán)重腦缺血，CaMKⅡ磷酸化水平及蛋白表達(dá)均降低［3］。永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，檢測出缺血2周CaMKⅡ活性呈現(xiàn)為先升高后降低，最后顯著低于正常的變化過程［4］。

2.2 CaMKⅡ與興奮性毒性 興奮性毒性是神經(jīng)缺血損失的原因之一，腦缺血觸發(fā)神經(jīng)元缺氧去極化，解除了Mg2+對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)抑制，同時(shí)，腦缺血過程中，谷氨酸的濃度升高，過度激活NMDAR受體和AMPA受體(AMPAR)誘發(fā)Ca2+超載，高濃度的Ca2+激活了細(xì)胞凋亡和壞死信號(hào)通路，而CaMKⅡ恰是興奮性毒性-Ca2+超載—細(xì)胞損傷通路中關(guān)鍵性酶，因此，CaMKⅡ及其底物變化涉及缺血性神經(jīng)損傷［5］。

2.3 CaMKⅡ自身磷酸化與神經(jīng)缺血損傷 在大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)模型和原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層細(xì)胞上證實(shí)，用特異性抑制CaMKⅡ活性的肽tatCN21、tatAIP抑制Ca2+依賴的磷酸化和自身磷酸化，可明顯減輕谷氨酸所致的神經(jīng)元損傷，這種保護(hù)效應(yīng)即使在皮層細(xì)胞損傷發(fā)生2 h之后，應(yīng)用tatCN21仍然出現(xiàn);而傳統(tǒng)的CaMKⅡ抑制劑KN93只在損傷刺激存在期間具有神經(jīng)保護(hù)作用，隨著損傷刺激結(jié)束，其保護(hù)作用消失。這是因?yàn)镵N93不能抑制損傷刺激誘發(fā)的CaMKⅡ自身磷酸化，而tatCN21和tatAIP不僅可以抑制Ca2+依賴的磷酸化，還可以抑制CaMKⅡ自身磷酸化。CaMKⅡ自身磷酸化被認(rèn)為是恢復(fù)血流后細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一，提示抑制CaMKⅡ自磷酸化可能是啟動(dòng)腦缺血損傷保護(hù)作用更為重要的靶點(diǎn)。同樣，CaMKⅡ自磷酸化缺失的基因突變體T286A小鼠，較CaMKⅡ過度表達(dá)的野生型小鼠，更能耐受谷氨酸興奮毒性［2］。然而，Waxham 等［6］發(fā)現(xiàn)，缺血時(shí) CaMKⅡ基因敲除小鼠比野生型小鼠腦梗塞面積大2倍，提示，盡管抑制CaMKⅡ活性可保護(hù)細(xì)胞，但CaMKⅡ的完全消失對(duì)缺血后細(xì)胞的生存卻是致命的。低水平CaMKⅡ活性對(duì)缺血后神經(jīng)元功能的維持可能是至關(guān)重要的。

2.4 CaMKⅡ-PSD-95-GluR6復(fù)合體與腦缺血損傷 CaMKⅡ的活性異常是引發(fā)腦缺血再灌損傷的重要因素之一，這與興奮性突觸后密集區(qū)相關(guān)蛋白(PSDp)介導(dǎo)的突觸后信號(hào)通路的激活有關(guān)。位于興奮性突觸后密集區(qū)(PSD)的相關(guān)蛋白主要有CaMKⅡ、PSD-95和GluR6等，是在興奮性突觸后密集區(qū)中純化鑒定出的一種腳手架蛋白。通過其蛋白分子中的PDZ(1-3)、SH3和GK結(jié)構(gòu)域，PSD-95可募集多種信號(hào)分子，在谷氨酸受體的信號(hào)整合和轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用［7］。

腦血管結(jié)扎腦缺血再灌注時(shí)，谷氨酸釋放激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ易化CaMKⅡ-PSD-95-GluR6復(fù)合體的形成，促使GluR6的絲氨酸磷酸化，進(jìn)一步激活JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，即谷氨酸的興奮性毒性作用。Liu等用CaMKⅡ的反義核苷酸抑制CaMKⅡ的表達(dá)，減輕了缺血再灌注3～5 d的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡，進(jìn)一步提示CaMKⅡ蛋白量的增高及與突觸后密集區(qū)相關(guān)蛋白的相互作用在腦缺血再灌損害中的作用［8，9］。

2.5 CaMKⅡ激活介導(dǎo)缺血性神經(jīng)損傷的機(jī)制 盡管通過抑制CaMKⅡ自磷酸化可以減輕缺血后細(xì)胞死亡的研究結(jié)果很多，這些研究也證實(shí)了CaMKⅡ自磷酸化引起的異常激活與缺血性神經(jīng)細(xì)胞的損傷有關(guān)，但其確切機(jī)制仍不十分清楚。目前認(rèn)為，可能與CaMKⅡ誘發(fā)的促細(xì)胞死亡因素的活性被削弱有關(guān)。與CaMKⅡ激活有關(guān)的促進(jìn)細(xì)胞死亡的因素包括:①缺血壞死與凋亡相關(guān)的AMPA受體。AMPA受體(GluR1 S831)磷酸化后其電導(dǎo)增加，進(jìn)而誘發(fā)致死性的Ca2+超載。與GluR1基因等效的AMPA受體，其活化后比介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流的GluR2受體具有更明顯的致細(xì)胞死亡的效應(yīng)［10］。②VDCCs通道激活。CaMKⅡ通過易化或增強(qiáng)VDCCs通道，進(jìn)一步加重Ca2+超載［11］。③細(xì)胞間的連接蛋白穩(wěn)定性降低。CaMKⅡ直接作用于細(xì)胞間的連接蛋白，破壞腦組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，使神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞之間信息與物質(zhì)的交流減少，最終引起細(xì)胞死亡［12］。④質(zhì)子敏感的離子通道被激活。通過磷酸化質(zhì)子敏感的離子通道，增強(qiáng)缺血激活離子通道的活性，也是CaMKⅡ引起神經(jīng)細(xì)胞死亡的原因之一［13］。⑤CPEB4向胞核轉(zhuǎn)位。最近研究發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡ激活誘發(fā)的CPEB4由胞質(zhì)穿梭至胞核，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)原性損傷機(jī)制，是CaMKⅡ介導(dǎo)的缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡的又一通路。CPEB4基因敲除同樣導(dǎo)致神經(jīng)元死亡;通過導(dǎo)入該基因使其重新表達(dá)，則可阻斷或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的死亡。CaMKⅡ異常激活所致的細(xì)胞核CPEB4積聚或向核內(nèi)轉(zhuǎn)位可能是CaMKⅡ介導(dǎo)的缺血性神經(jīng)元死亡的機(jī)制之一［14］。

3 CaMKⅡ膜轉(zhuǎn)位在腦缺血性損傷保護(hù)中的作用

生理情況下，絕大部分CaMKⅡ作為可溶性成分存在于胞質(zhì)中，其余小部分存在于膜相結(jié)構(gòu)中。腦缺血15 min后，大鼠皮層和海馬的膜相成分中CaMKⅡ增加50%，提示缺血促進(jìn)了CaMKⅡ由胞質(zhì)向胞膜轉(zhuǎn)位，這種轉(zhuǎn)位與PKC的不可逆膜轉(zhuǎn)位不同，短暫缺血所致的CaMKⅡ在胞質(zhì)和胞膜之間的轉(zhuǎn)位是可逆的。短暫缺血后，胞質(zhì)CaMKⅡ活性仍然可以被檢測，但CaMKⅡ mRNA明顯降低，表達(dá)的下降，及膜轉(zhuǎn)位引起的胞質(zhì)CaMKⅡ活性進(jìn)一步下調(diào)［15］。

腦缺血后谷氨酸的釋放，作用到NMDA受體，引起Ca2+內(nèi)流，最終導(dǎo)致CaMKⅡ兩個(gè)方向的轉(zhuǎn)位。首先是向突觸后膜和突觸外簇的轉(zhuǎn)位。生理情況下，谷氨酸刺激誘發(fā)CaMKⅡ向突觸后膜轉(zhuǎn)位，并與幾種突觸蛋白結(jié)合，維持突觸正常形態(tài)及可塑性，參與學(xué)習(xí)與記憶過程;病理情況下，谷氨酸刺激和缺血狀態(tài)，使CaMKⅡ轉(zhuǎn)移到突觸膜，與幾種突觸蛋白特別是GluN2B(NR2B)結(jié)合，形成一種非溶解狀態(tài)的復(fù)合物介導(dǎo)突觸蛋白的凝聚［16，17］。上述兩種類型的轉(zhuǎn)位皆需經(jīng)由CaMKⅡ T位點(diǎn)的蛋白相互作用。CaMKⅡ與突觸蛋白的聚集需pH低于6.8的環(huán)境條件，腦缺血時(shí)局部酸中毒可能有利于這種聚集，其詳細(xì)分子機(jī)制尚不十分清楚，目前認(rèn)為可能與自磷酸化時(shí)α螺旋鉸鏈的282位組氨酸質(zhì)子化有關(guān)［18］。

腦缺血過程中，Ca2+/CaM誘發(fā)的CaMKⅡ轉(zhuǎn)位或聚集使其在胞質(zhì)中的活性降低，進(jìn)而減輕胞質(zhì)CaMKⅡ異常激活引起的細(xì)胞損傷。推測CaMKⅡ的移位和聚集可能是缺血時(shí)細(xì)胞啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)性機(jī)制的方式之一。

4 適當(dāng)濃度的CaMKⅡ?qū)θ毖阅X損傷具有保護(hù)作用

Ashpole等［5］將海馬神經(jīng)元暴露于谷氨酸的興奮毒性作用，并在暴露前、后短時(shí)間應(yīng)用KN-93、tat-AIP及tat-CN21等CaMKⅡ抑制劑，發(fā)現(xiàn)抑制CaMKⅡ異常激活可降低海馬神經(jīng)元的死亡率。雖然抑制CaMKⅡ過度激活可產(chǎn)生保護(hù)作用，但持續(xù)抑制CaMKⅡ活性超過8 h后，保護(hù)作用丟失，細(xì)胞死亡率反而升高。過度抑制CaMKⅡ的活性得到相反的結(jié)果，這些研究提示，維持胞質(zhì)中CaMKⅡ一定程度活性對(duì)細(xì)胞生存至關(guān)重要。

適量活化的CaMKⅡ通過以下4個(gè)方面的機(jī)制減輕細(xì)胞的損傷:①CaMKⅡ通過磷酸化nNOS，抑制其活性，降低一氧化氮合成酶(nNOS)誘發(fā)的神經(jīng)元損害。盡管谷氨酸的釋放會(huì)產(chǎn)生一定程度的興奮性毒性，但恰當(dāng)濃度的CaMKⅡ通過谷氨酸激活NMDA受體，可分解nNOS，減少NO的產(chǎn)生，減輕自由基對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷［19，20］;②CaMKⅡ可通過調(diào)節(jié)某些離子通道減輕興奮性毒性作用對(duì)神經(jīng)元的損傷。如:磷酸化GluN2B受體(ser1303)，促進(jìn)興奮性效應(yīng)的 NMDA受體脫敏，增強(qiáng)抑制性效應(yīng)的GABAα受體表達(dá)，從而減輕神經(jīng)元的興奮性毒性作用;③恰當(dāng)濃度的CaMKⅡ和CaMKIV可以激活具有細(xì)胞保護(hù)作用的蛋白如ErK和ScrB，同時(shí)又可抑制對(duì)細(xì)胞具有損害作用的蛋白如GSK-3和Bad，起到減輕細(xì)胞損傷的保護(hù)性作用;④組蛋白脫乙?；?(HDAC5)為CaMKⅡ的底物，HDAC5抑制保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子 MEF的產(chǎn)生，CaMKⅡ通過抑制HDAC5，從而增強(qiáng)MEF表達(dá)，從而間接發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)性作用。

5 結(jié)語

神經(jīng)缺血損傷過程中，CaMKⅡ的作用較為復(fù)雜，一方面胞質(zhì)中一定水平的CaMKⅡ活性是維持細(xì)胞生存的必要條件之一;另一方面，胞質(zhì)CaMKⅡ異常激活又可觸發(fā)細(xì)胞死亡信號(hào)通路而加重細(xì)胞損傷，如何恰當(dāng)調(diào)控細(xì)胞質(zhì)CaMKⅡ的濃度及活性，既保持細(xì)胞生存所必需又不致引起異常激活的細(xì)胞損傷是未來該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

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