苗立業(yè)，邢 軍，李秀偉

(1 河北聯(lián)合大學(xué)，河北唐山 063000;2 河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院)

研究表明，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)和宮頸癌的主要致病因素，宮頸鱗癌患者HPV16感染較為多見［1］。組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)是表觀遺傳調(diào)控中的關(guān)鍵酶，能夠介導(dǎo)核小體的結(jié)構(gòu)改變和調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞周期的進(jìn)程和分化。細(xì)胞周期調(diào)控抑癌基因P21waf作為細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子之一，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和衰老。2008年6月～2011年6月，我們對(duì)不同病變宮頸組織中HPV16感染情況及其與HDAC1和P21waf的關(guān)系進(jìn)行了研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2008年6月～2011年6月存檔的宮頸病變組織蠟塊110份，取樣時(shí)患者年齡25～72歲、中位年齡44.5歲。取樣前均未經(jīng)放療和化療。均由病理科醫(yī)師診斷及確定組織學(xué)分級(jí)，其中慢性宮頸炎20份(宮頸炎組);CIN 70份，包括CINⅠ22份(CINⅠ組)、CINⅡ24份(CINⅡ組)、CINⅢ24份(CINⅢ組);宮頸癌20份(宮頸癌組)。主要試劑:HDAC1兔抗體人多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;P21waf鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;HPV16型引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。HPV16引物序列:上游為5'-TCAAAAGCCACTGTGTCCTG-3'，下游為 5'-CGTGTTCTTGATGATCTGCA-3'，長(zhǎng)度為 120 bp。

1.2 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 HDAC1、P21waf表達(dá) 采用免疫組化 SP法，按試劑盒說(shuō)明書操作，DAB光鏡下控制染色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，干燥中性樹膠封片。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。HDAC1陽(yáng)性為宮頸異常鱗狀上皮細(xì)胞核和少量細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，P21waf陽(yáng)性為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。光鏡下每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)有代表性的視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞并觀察染色強(qiáng)度，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及染色強(qiáng)度計(jì)分。陽(yáng)性細(xì)胞＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～49%為2分，≥50%為3分。無(wú)著色為0分，弱著色為1分，中等著色為2分，強(qiáng)染色為3分。兩項(xiàng)評(píng)分相加為0～1分判為陰性(-)，2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為中度陽(yáng)性(++)，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ＜5%的無(wú)論染色強(qiáng)度均判為(-)。

1.2.2 HPV16 DNA檢測(cè) 采用常規(guī)方法提取組織切片中的 HPV DNA，取 25 μL 2 × PCR Master，1 μL DNA模板，上下游引物各1 μL及22 μL去離子水放入PCR反應(yīng)管中，通過(guò)變性、退火、延伸、循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，染色。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，于2%瓊脂糖凝膠中電泳，與DNA標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量(600 bp)進(jìn)行對(duì)照，120 bp處出現(xiàn)條帶者為HPV16 DNA陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件，行計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)和等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 DNA陽(yáng)性率 宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組、宮頸癌組HPV16 DNA陽(yáng)性率分別為10%(2/20)、36.4%(8/22)、50.0%(12/24)、66.7%(16/24)、75.0%(15/20)，CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組、宮頸癌組陽(yáng)性率均高于宮頸炎組(P均＜0.05)，CINⅢ組、宮頸癌組陽(yáng)性率均高于CINⅠ組(P 均 ＜0.05)。

2.2 HDAC1、P21waf表達(dá) 宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和宮頸癌組HDAC1表達(dá)逐漸增強(qiáng)，表達(dá)強(qiáng)度與病理級(jí)別呈正相關(guān)(r=0.529，P＜0.01)。宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組及宮頸癌組P21waf表達(dá)逐漸降低，表達(dá)強(qiáng)度與病理級(jí)別呈負(fù)相關(guān)(r=-0.385，P ＜0.01)。見表1。

2.3 HPV16感染與HDAC1、P21waf的關(guān)系 各組HDAC1表達(dá)與HPV16感染均呈正相關(guān)(r=0.510，P ＜0.05)，P21waf表達(dá)與 HPV16 感染呈負(fù)相關(guān)(r=-0.468，P ＜0.05)。見表2。

表1 各組 HDAC1、P21waf表達(dá)

2.4 HDAC1與 P21waf的關(guān)系 各組 HDAC1的表達(dá)強(qiáng)度與 P21waf呈負(fù)相關(guān)(r=-0.349，P ＜0.05)。見表3。

表2 HPV16感染與HDAC1、P21waf的關(guān)系(例)

表3 HDAC1與P21waf表達(dá)的關(guān)系(例)

3 討論

我國(guó)是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，并且有年輕化趨勢(shì)［2］。研究表明HPV16、18與宮頸癌及癌前病變關(guān)系密切，在世界范圍內(nèi)，50%以上的宮頸癌與HPV16感染有關(guān)［3］。HPV慢性持續(xù)感染后，其E6、E7癌基因整合入宿主細(xì)胞基因組中，產(chǎn)生的E6、E7癌蛋白可引起遺傳基因改變，如癌基因激活、抑癌基因失活和表觀遺傳學(xué)組蛋白修飾改變(如組蛋白去乙酰化等)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，HPV16在宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和宮頸癌組中的感染率分別為10%、36.4%、50%、66.7%、75%，提示隨著宮頸病變的加重，HPV16的感染率逐漸增加，與黃順玲等［4］的研究結(jié)果一致。

HDAC1能夠移去組蛋白Lys殘基上的乙酰基，恢復(fù)組蛋白的正電性，增加組蛋白與DNA之間的吸引力，使啟動(dòng)子不容易接近DNA上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，從而抑制DNA轉(zhuǎn)錄。HDAC1除了移去組蛋白的乙酰基外，還可移去非組蛋白上的乙?；?，從而使部分非組蛋白失去其原有的腫瘤抑制功能，例如移去P53蛋白、Rb蛋白、P21蛋白等的乙酰基可導(dǎo)致其功能喪失，引起細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，致使腫瘤發(fā)生、進(jìn)展。目前研究顯示，HDAC1在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)可明顯增加腫瘤細(xì)胞的增殖能力，并且可以使腫瘤細(xì)胞的侵襲和移行能力明顯增強(qiáng)［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和宮頸癌組HDAC1的表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且HDAC1蛋白表達(dá)強(qiáng)度與病變級(jí)別呈正相關(guān)，提示HDAC1與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能作為宮頸癌演進(jìn)過(guò)程中的分子標(biāo)記物［6］。

HDAC和SP1競(jìng)爭(zhēng)與P21基因啟動(dòng)子的結(jié)合，能夠?qū)е翽21waf蛋白轉(zhuǎn)錄抑制，從而引起腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，其抑制劑可以抑制HDAC和SP1競(jìng)爭(zhēng)與P21基因啟動(dòng)子的結(jié)合，促進(jìn)P21waf蛋白轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤的發(fā)生。目前已有研究證明，HDAC抑制劑在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌中可能通過(guò)調(diào)節(jié)P21waf蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。王慧等［7］將HDAC抑制劑SAHA作用于體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株Siha，發(fā)現(xiàn)SAHA在體外能有效抑制Siha生長(zhǎng)，且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯影響，其抗腫瘤機(jī)制之一可能是通過(guò)上調(diào)P21waf蛋白表達(dá)水平和引起G0/G1期細(xì)胞周期阻滯實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)P21waf在宮頸病變中扮演的是腫瘤抑制基因的角色，且P21waf在宮頸癌中的失活是通過(guò)HPV16感染后癌基因E7發(fā)揮作用的［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組及宮頸癌組，P21waf陽(yáng)性表達(dá)率逐漸減低，表達(dá)強(qiáng)度與病變級(jí)別呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合HDAC1與不同病變宮頸組織的病理級(jí)別呈正相關(guān)，說(shuō)明在宮頸病變中HDAC1的高表達(dá)可能抑制P21waf蛋白的表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，HPV16持續(xù)感染后，引起HDAC1高表達(dá)和P21waf的低表達(dá)，說(shuō)明HPV16感染有可能是通過(guò)提高HDAC1水平、抑制P21waf的表達(dá)，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。三者聯(lián)合檢查能提高宮頸癌篩查的陽(yáng)性率。

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