陳 璐，李素荷，鐘國(guó)新，樊永磊，張 璇，黃志毅

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405)

慢性萎縮性胃炎(CAG)是指不同病因引起的慢性胃黏膜萎縮性病變。Toll樣受體(TLR)是一種跨膜受體蛋白，通過(guò)識(shí)別細(xì)菌、真菌、細(xì)胞壞死成分等內(nèi)源性或外源性配體，參與炎癥反應(yīng)并促進(jìn)和提高免疫應(yīng)答［1］。研究已證實(shí)在胃黏膜感染Hp后，TLR4表達(dá)增加，從而使核因子－κB(NF－κB)活化，而過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)是炎癥發(fā)生的重要機(jī)制之一［2］。NF－κB是一類與DNA結(jié)合的二聚體蛋白，為細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［3］。NF－κB激活后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)與DNA相結(jié)合啟動(dòng)并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。TLR4/NF－κB信號(hào)介導(dǎo)了胃部疾病的炎癥反應(yīng)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)旨在探討穴位埋線對(duì)TLR4/NF－κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，從而更好地指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

60只SPF級(jí)8周齡SD大鼠(由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK粵2008－0002)，雌雄各半，體重180～220 g，采用架式籠養(yǎng)，恒溫(20±1)℃，濕度50% ～60%，光照黑暗各12 h交替，自動(dòng)通風(fēng)8～15次/h條件下飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、自然恢復(fù)組、埋線組，每組15只。

1.2 主要試劑及器械

試劑:甲基－硝基－亞硝基胍(MNNG，生產(chǎn)批號(hào):GNGMH日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，兔抗鼠TLR4多克隆抗體 (生產(chǎn)批號(hào):BA0299，美國(guó)Abcame)，兔抗鼠NF－κB多克隆抗體(生產(chǎn)批號(hào):BA0614，美國(guó)Abcame)，SP試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):C0103，武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):ARl012，武漢博士德生物工程有限公司)，10%中性緩沖福爾馬林固定液(生產(chǎn)批號(hào)11011301，廣州維格斯生物科技有限公司)。器械:①針具:6號(hào)一次性注射針頭(浙江京環(huán)醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn))，華佗牌30號(hào)1.5寸不銹鋼毫針(蘇州醫(yī)療用品廠);②埋植用羊腸線:0000號(hào)鉻制羊腸線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)。

1.3 模型復(fù)制與治療

正常對(duì)照組普通飼料正常喂養(yǎng)。除正常對(duì)照組外，其余各組于普通飼料喂養(yǎng)1周后，采用自由飲用100 mg/L甲基－硝基－亞硝基胍(MNNG)配合饑飽失常法復(fù)制大鼠CAG模型［4－6］。將MNNG用蒸餾水配制成1 g/L濃度的儲(chǔ)存液，4℃冰箱避光冷藏保存，每周配制1次，用時(shí)將儲(chǔ)存液配成100 mg/L濃度的飲用液，裝入包裹錫紙的飲水瓶中，每天更換，讓大鼠自由飲用，同時(shí)配合饑飽失常，連續(xù)造模12周。于第12周末，各組隨機(jī)抽取2只大鼠處死，取胃，行病理檢查，判斷模型成功與否。CAG的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)制定［7］:固有腺體萎縮;黏膜肌層增厚;可有腸上皮化生或假幽門腺上化生;固有膜炎癥;可有淋巴濾泡形成。

造模成功后將正常對(duì)照組、模型組大鼠處死，取材固定;自然恢復(fù)組大鼠普通飼料正常喂養(yǎng)，只抓取不治療;埋線組選取大鼠“足三里”、“中脘”、“脾俞”穴埋線治療［8］。操作:定位后使用彎剪、脫毛露先行脫毛，毛脫盡后用生理鹽水擦拭脫毛部位，以減少脫毛露對(duì)大鼠皮膚的刺激。準(zhǔn)備完畢后，穴位用2.5%的碘酒消毒，75%的酒精脫碘。將0.5 cm長(zhǎng)的0000號(hào)羊腸線從6號(hào)注射針頭的針尖處裝入針體，此時(shí)注射針頭內(nèi)作為針芯的30號(hào)1.5寸不銹鋼毫針稍退后，線頭與針尖內(nèi)緣齊平，背腰部穴位在局部下方向上平刺、腹部斜刺、下肢穴位直刺，刺至所需深度，邊推針芯，邊退針管，將羊腸線埋植于穴位皮下組織或肌層內(nèi)，線頭不外露，消毒針孔。每周治療1次，共治療8周。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1.4.1 胃黏膜組織病理學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食、禁水24 h，乙醚吸入麻醉，剖腹，距賁門和幽門1.5 cm離斷取出全胃并處死。沿胃大彎側(cè)剖開(kāi)，冰生理鹽水沖洗后，濾紙吸干鋪開(kāi)，固定于10%中性甲醛，常規(guī)取材，石蠟包埋，包埋組織進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚4～5 μm，蘇木素－伊紅染色(HE染色)，置光鏡下觀察，并進(jìn)行顯微攝影。

1.4.2 免疫組化法檢測(cè)TLR4和NF－κB表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠胃黏膜組織進(jìn)行石蠟包埋，包埋組織進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚4～5 μm，附于多聚賴氨酸包被的載玻片備用。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、微波抗原修復(fù)后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)以SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，檢測(cè)TLR4和NF－κB的表達(dá)。顯微鏡下，細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色著染為陽(yáng)性細(xì)胞。Olympus病理圖像采集系統(tǒng)400倍光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，使用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析，并計(jì)算平均光密度值(OD值)。

1.4.3 胃黏膜超微結(jié)構(gòu)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠取出全胃并處死。沿胃大彎側(cè)剖開(kāi)，于胃小彎處快速取約0.1 cm ×0.1 cm ×0.5 cm 的組織(包括胃竇及部分胃體)投入30 g/L戊二醛固定，緩沖液洗滌后再經(jīng)10 g/L四氧化鋨4℃后固定1 h，雙蒸水漂洗，逐級(jí)丙酮脫水，環(huán)氧丙烷置換，Epon12包埋。聚合過(guò)程:37℃，12 h;45℃，24 h;60℃，24 h。聚合完成后，做超薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，JEM－1200EX透射電鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胃黏膜組織病理改變

由封三彩圖1可見(jiàn)，A正常對(duì)照組:胃黏膜層厚度大，上皮細(xì)胞及腺體排列整齊，大小形狀一致，細(xì)胞呈單層柱狀，胞質(zhì)透明或空泡狀，腺體豐富與胃小凹分界清晰，固有腺及粘膜無(wú)充血、水腫，黏膜肌層無(wú)增生;B模型組:胃黏膜層變薄，肌層增寬，胃小凹變淺，腺體變小，排列紊亂，數(shù)量減少，并有囊性擴(kuò)張，間質(zhì)有纖維組織增生及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)腸上皮化生現(xiàn)象;C自然恢復(fù)組:胃黏膜層變薄，固有膜內(nèi)有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層增寬，胃小凹變淺，腺體排列紊亂，腺體大小不規(guī)則，可見(jiàn)明顯囊性擴(kuò)張，腺體數(shù)目減少;D埋線組:胃黏膜層無(wú)明顯變薄，胃小凹之間的固有膜內(nèi)，可見(jiàn)少量漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層無(wú)增寬，腺體排列整齊，腺體大小稍不規(guī)則，數(shù)量未見(jiàn)明顯減少，但部分腺體可見(jiàn)囊性擴(kuò)張。

2.2 大鼠胃黏膜組織中TLR4和NF－κB的免疫組化表達(dá)情況

各組免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞(棕褐色)見(jiàn)封三彩圖2、3。TLR4和NF－κB均呈現(xiàn)正常對(duì)照組低表達(dá)，模型組和自然恢復(fù)組高表達(dá)，埋線組中度表達(dá)。

半定量統(tǒng)計(jì)目標(biāo)蛋白表達(dá)量(平均光密度)見(jiàn)表1。各組TLR4表達(dá)水平，模型組和自然恢復(fù)組均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，自然恢復(fù)組與模型組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，埋線組較模型組表達(dá)減少(P＜0.05)，埋線組與自然恢復(fù)組比較表達(dá)減少(P＜0.05)。各組NF－κB表達(dá)水平，模型組和自然恢復(fù)組均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，自然恢復(fù)組與模型組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，埋線組明顯低于模型組(P＜0.01)，埋線組與自然恢復(fù)組比較表達(dá)減少(P＜0.05)。

表1 各組TLR4、NF－κB表達(dá)平均光密度比較(±s)

表1 各組TLR4、NF－κB表達(dá)平均光密度比較(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＞0.05;與模型組比較，cP ＜0.05，dP ＜0.01;eP ＜0.05。

組別 n TLR4/(OD·μm－2) NF－κB/(OD·μm－2)正常對(duì)照組13 0.048 ±0.014 0.057 ±0.022模型組 13 0.213 ±0.019a 0.199 ±0.024a自然恢復(fù)組 13 0.196 ±0.010ab 0.183 ±0，010ab埋線組 13 0.145 ±0.012ace 0.120 ±0.017ade

2.3 大鼠胃黏膜組織超微結(jié)構(gòu)改變

由封三彩圖4可見(jiàn)，正常對(duì)照組:A1:壁細(xì)胞在胃底腺的腺頸部及腺體上半部較多，細(xì)胞較大，核呈卵圓形，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)分泌小管，小管直徑約1～2 μm，表面有許多微絨毛，小管與胃底腺管腔相通，當(dāng)壁細(xì)胞分泌鹽酸時(shí)，分泌小管管徑增大，靜止期壁細(xì)胞分泌小管往往縮小以至閉塞，但見(jiàn)微管泡增多，此外壁細(xì)胞內(nèi)有豐富的線粒體，線粒體呈圓形或長(zhǎng)方形。嵴密呈板層狀，胞質(zhì)內(nèi)還可見(jiàn)少量溶酶體等;A2:主細(xì)胞又稱酶原細(xì)胞，主要分布于胃腺的基底部及體部，細(xì)胞核位于基部，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少量線粒體和許多有界膜的酶原顆粒，酶原顆粒以胞吐的形式分泌蛋白酶至腺腔。模型組:B1:壁細(xì)胞可見(jiàn)輕度核固縮，細(xì)胞內(nèi)分泌小管擴(kuò)張，微絨毛突起退變，線粒體數(shù)量減少，而且線粒體的結(jié)構(gòu)有明顯的損傷，其主要表現(xiàn)為線粒體腫脹，膜缺損，嵴斷裂、基質(zhì)變淡等;B2:主細(xì)胞核仁萎縮，染色不均勻，核膜擴(kuò)張迂曲，有深淺不等的凹陷，胞質(zhì)稀疏，散在擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，部分成囊狀，酶原顆粒胞膜不清，分泌顆粒減少，甚至消失。自然恢復(fù)組:C1:壁細(xì)胞水腫、微管泡系統(tǒng)明顯減少，泡內(nèi)可見(jiàn)絮狀物質(zhì)，基質(zhì)出現(xiàn)大量液化現(xiàn)象，線粒體明顯減少，嵴模糊不清、空泡變性或嵴斷裂，可見(jiàn)輕微核固縮;C2:主細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體明顯減少，酶原顆粒胞膜不清，分泌顆粒減少，甚至消失。埋線組:D1:壁細(xì)胞連接完好，核圓而染色尚均勻，線粒體豐富、結(jié)構(gòu)清楚，微絨毛結(jié)構(gòu)正常，胞漿內(nèi)可見(jiàn)粘原顆粒和豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);D2:主細(xì)胞核圓且位于細(xì)胞底部，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，酶原顆粒豐富，線粒體板層嵴清晰可見(jiàn)。

3 討論

TLR4/NF－κB通路是各種炎癥反應(yīng)的重要傳導(dǎo)通路之一［9］。TLR4是廣泛分布于不同細(xì)胞表面的受體，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)NF－κB信號(hào)通路，活化的NF－κB進(jìn)入細(xì)胞核通過(guò)與DNA相結(jié)合啟動(dòng)并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，趨化和激活嗜中性粒細(xì)胞，活化淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)固有和獲得性免疫［10－11］。NF－κB 是炎癥呈持續(xù)放大反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。目前已證實(shí)慢性萎縮性胃炎胃黏膜的IL－1、IL－6、IL－8及TNF－α等細(xì)胞因子和化學(xué)趨化因子升高相關(guān)，這些細(xì)胞因子和化學(xué)趨化因子可引起中性粒細(xì)胞的聚集和激活，從而可引起活動(dòng)性炎癥反應(yīng)［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠慢性萎縮性胃炎模型中TLR4、NF－κB表達(dá)均顯著上調(diào)，提示 TLR4/NF－κB通路激活介導(dǎo)了萎縮性胃炎的炎癥過(guò)程。經(jīng)埋線治療后大鼠胃黏膜組織TLR4、NF－κB表達(dá)較模型組和自然恢復(fù)組顯著下調(diào)，提示其胃黏膜保護(hù)作用可能與抑制TLR4/NF－κB通路以減輕慢性炎癥損傷有關(guān)，穴位埋線對(duì)于胃黏膜慢性炎癥的改善在組織病理學(xué)上也得到了印證。另外，超微結(jié)構(gòu)的改變主要體現(xiàn)在壁細(xì)胞線粒體和主細(xì)胞溶酶體上，穴位埋線能夠明顯改善線粒體、溶酶體的損傷，從而促進(jìn)胃黏膜血液循環(huán)，促使胃黏膜各種異常的超微結(jié)構(gòu)恢復(fù)［13］，從而起到對(duì)胃黏膜的保護(hù)和修復(fù)作用。

［1］Akiras，Takedak.Toll like receptor signaling［J］.Nature revimmunol，2004，4(7):499 －511

［2］Skaug B，Jiang X，Chen ZJ.The Role of Ubiquitinin NF － κB Regulatory Pathways［J］.Annu Rev Biochem，2009，78:769 －796

［3］Sun S C，Ley S C.New insight s into NF －κB regulation and function［J］.Trends in Immunology，2008，29(10):4692478

［4］李守朝，周曉燕，王峰，等.參佛胃康對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠胃酸、胃蛋白酶活性和血清胃泌素含量的影響［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，20(1):64 －65

［5］陸為民，單兆偉，吳靜，等.大鼠慢性萎縮性胃炎癌前病變氣虛血瘀證動(dòng)物模型的研制［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，16(3):156－158

［6］查煒，王茵萍，吳旭，等.穴位注射療法對(duì)MNNG致慢性萎縮性胃炎大鼠肝組織病理及SOD影響［J］.上海針灸雜志，2004，23(9):39－41

［7］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002:125－129

［8］林文注.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994

［9］Medzlutov R，Janeway CA Jr.An aneient system of host defense［J］.Curr Opin Immunol，1998，10(1):12 － 15

［10］MedzhitovR，Janeway CA.Innate immunity impact on the adaptiveimmune response［J］.Curr Opin Immunol，1997，9:4 － 9

［11］GretchenV.Fly development genes lead to immune find［J］.Science，1998，25(281):1945 －1949

［12］史彤，劉文忠，高飛，等.幽門螺桿菌刺激胃癌細(xì)胞株SGC－7901分泌白細(xì)胞介素－8過(guò)程中核因子κB的作用［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83(2):133 －136

［13］梁平.慢性萎縮性胃炎超微結(jié)構(gòu)研究［J］.中華內(nèi)科，1982，2(4):220－221