唐祎周，孫忠人，張 翀

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱 150040)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。大量研究表明SCI后的繼發(fā)性損傷才是導致其功能障礙的主要原因。繼發(fā)性損傷早期具有可逆性［1］，后期則造成脊髓功能永久性喪失。細胞凋亡(apoptosis)是機體生長發(fā)育、細胞分化和病理狀態(tài)中細胞自主性死亡過程。死亡受體活化和線粒體損傷途徑是細胞內(nèi)兩條經(jīng)典的凋亡途徑［2］，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激啟動的凋亡途徑是近年才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可誘導未折疊蛋白反應，其感受器為 Irel蛋白［3］。本研究通過觀察脊髓損傷后細胞凋亡情況及損傷處IRE1蛋白表達的變化，探討電針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡的影響及其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠132只，體重(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。使用隨機數(shù)字表隨機分為假手術(shù)組、模型組、對照組、疏波組4組，每組分為8 h、3 d、7 d三個時相點，每個時相點11只。分籠飼養(yǎng)，室溫保持在(22±2)℃，自由飲水進食，適應環(huán)境，保持正常的12 h白天和黑夜交替周期。

1.2 主要儀器和試劑

手術(shù)顯微鏡(四川科奧達)、moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國)、Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination(Sigma)SDS－PAGE凝膠配制試劑盒(Beyotime)、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)、Irea－1抗體(ADCAM，美國)。

1.3 動物模型的制備

大鼠用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)經(jīng)腹腔進行麻醉，固定后備皮，常規(guī)消毒，以胸8棘突為中心，沿脊柱方向取一長約3.0 cm的切口，切開皮膚、肌肉，分離并顯露棘突，游離附著于棘突兩側(cè)的骶棘肌，將胸8棘突椎板全部切除，保留硬脊膜。用改良式Allen's WD裝置，以脊髓后正中血管為中心，采用5 g沖擊棒自10 cm高度垂直自由下落擊打于脊髓背側(cè)圓形薄銅墊片(直徑 0.3 cm，重 0.001 g)上，打擊面積約7.00 mm2，打擊力度約為0.05 N。造模成功的標志:下落撞擊后，見鼠尾痙攣性擺動、雙下肢及軀體回縮撲動后，雙下肢癱瘓，標志撞擊成功。術(shù)后將大鼠飼養(yǎng)于保持在(22±2)℃室溫，相對溫度60% ～80%環(huán)境中正常喂養(yǎng)。各組于術(shù)后1 h給予腹腔注射2萬μ/kg青霉素，每日兩次，持續(xù)3日。各組于術(shù)后每日3次進行膀胱區(qū)按壓排尿，防止尿潴留及泌尿系感染。

1.4 干預方法

1.4.1 假手術(shù)組 只做椎板切除，不造成脊髓損傷。

1.4.2 模型組 脊髓Allen's打擊損傷后腹腔注射給予與對照組組等量生理鹽水，持續(xù)1周。

1.4.3 對照組 脊髓Allen's打擊損傷后30 min內(nèi)首次按30 mg/kg腹腔注射甲基強的松龍，隨后按5.4 mg/kg/h給藥，每1 h給藥一次，連續(xù)給23次。

1.4.4 疏波組(夾脊電針疏波治療組) 脊髓Allen's打擊損傷后立即采用電針治療，每日1次，每針刺6 d，休息1 d，持續(xù)1周。電針采用KWD－808II型脈沖電針儀，頻率2 Hz;輸出強度以背部肌肉出現(xiàn)輕微抽動為度。部位及操作參照《實驗針灸學》(中國中醫(yī)藥出版社出版)，大鼠穴位在損傷區(qū)上、下端的棘突間隙旁開距中線3～4 mm處取穴;操作:將6 mm華佗牌毫針(0.30 mm)垂直刺入約4～5 mm，使針尖觸及椎板，電極分別連接上下針柄，持續(xù)30 min，每日1次，針刺6 d，休息 1 d。

1.5 指標的檢測

1.5.1 TUNEL法檢測損傷處細胞凋亡 參照TUNEL凋亡試劑盒說明書，將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。滴加胃蛋白酶K(20μg/ml溶于10 mM的Tris/HCL中，PH值7.4～8.0)室溫(22 ±2)℃孵育 30 min，PBS沖洗 2次。擦干樣品周圍的水，滴加50 μl的Tunel反應混合液，孵育60 min，PBS沖洗3次。拭出水分，加入50 μl的轉(zhuǎn)化劑－POD，孵育30 min，PBS沖洗3次。滴加顯色劑DAB，室溫下10 min使其顯色，再用蒸餾水充分沖洗，蘇木素復染1 min。常規(guī)脫水透明后，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.5.2 Western blot檢測Ire－l蛋白表達 于各時間點麻醉動物后迅速取出脊髓，用細胞裂解液提取蛋白，SDS－PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，漂洗。用濾紙吸盡洗滌液，加入封閉液，4℃封閉過夜。一抗(1∶200兔抗鼠Irel，內(nèi)參為1∶50兔抗鼠13－actin)孵育，參考一抗的說明書，按照適當比例用Western－抗稀釋液稀釋一抗。37℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育1 h。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌10 min，共洗滌3次。二抗(1∶200HRP標記羊抗兔IgG)孵育，參考二抗的說明書，按照適當比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。加入稀釋好的二抗，37℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育1 h，洗滌3次。用DAB試劑盒顯色，直至顯色至預期深淺后，去除DAB染色工作液。用濾紙將膜吸干，避光放置20 min后，將膜置于掃描儀中掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.6 統(tǒng)計方法

應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素ANOVA等分析，若方差不齊，再用Duncan檢驗，P＜0.05時有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL檢測細胞凋亡

Tunnel染色顯示，光鏡下觀察假手術(shù)組脊髓神經(jīng)細胞，著色的細胞數(shù)量少，且數(shù)量與時間變化無關(guān)。模型組于各時相點均出現(xiàn)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的凋亡，具有典型的細胞凋亡特征性改變，細胞體積縮小，凋亡細胞胞質(zhì)濃縮，細胞核染色質(zhì)固縮，呈斑塊狀聚集于核膜周圍，細胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體。8 h時相點主要見于脊髓灰質(zhì)后角細胞凋亡現(xiàn)象陽性，3 d時相點均出現(xiàn)在灰質(zhì)和白質(zhì)凋亡細胞陽性，7 d時相點灰質(zhì)的陽性細胞減少，凋亡陽性細胞主要出現(xiàn)在白質(zhì)中。脊髓損傷后8 h、3 d、7 d，其前角可見散在的凋亡神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，并呈逐漸增多趨勢。疏波組及對照組同模型組相比，神經(jīng)元的損傷明顯減輕，說明電針治療對脊髓的神經(jīng)元有保護作用，并具有抗凋亡作用。見圖1。

2.2 夾脊電針對脊髓損傷大鼠IRE1的蛋白表達的影響

表1 SCI大鼠Ire－1不同時段各組平均光密度值比較

圖1 SCI大鼠7 d細胞凋亡情況

IRE1蛋白的表達將Western blot檢測結(jié)果與標準蛋白分子量比較，結(jié)果表明脊髓損傷造模后模型組8 h、3 d、7 d三個時相點IRE1蛋白表達均明顯上調(diào)，假手術(shù)組表達較少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。各時間點，模型組與對照組、疏波組比較，IRE1蛋白表達均有顯著性差異;對照組與疏波組比較，IRE1蛋白表達均有顯著性差異;且各時間點對照組數(shù)值均高于疏波組。見表1。

3 討論

繼發(fā)性脊髓損傷(sequential spinal cord injury，SSCI)通過一系列的生化反應加重神經(jīng)元的變性壞死或凋亡，嚴重損傷殘存神經(jīng)細胞［4］。細胞凋亡是繼發(fā)性脊髓損傷進行性加重、神經(jīng)元細胞發(fā)生不可逆改變的重要作用機制［5］。細胞內(nèi)線粒體和細胞外死亡受體相關(guān)的兩條途徑是以往關(guān)于細胞凋亡機制的主要研究方向。而最近幾年的相關(guān)研究表明除這兩條途徑外，還存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是合成脂類蛋和白質(zhì)的主要細胞器，同時指導蛋白質(zhì)的正確折疊和糖基化，并兼有儲存和維持胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)平衡功能。細胞急、慢性損傷改變了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)工作環(huán)境，使其蛋白質(zhì)的正確折疊和糖基化受到阻礙，導致未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔不斷堆積，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能紊亂。而紊亂達到一定程度后，將誘發(fā)一種可協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊的伴侶蛋白的表達，繼而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應。如果未折疊蛋白反應在時間或強度上達到相應的水平則會促誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而激活凋亡酶Caspase－12的大量表達，最終導致細胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應中，首先被激活的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜感受蛋白激酶 IRE1、Perk、和 Atf6，其中 IRE1和Perk是未折疊蛋白反應近端感受器。IRE1能通過某種機制檢測到未折疊蛋白的聚集，因此被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白感受器。活化的IRE1具有核酸內(nèi)切酶活性，可特異性剪切轉(zhuǎn)錄因子XBP－1mRNA抑制序列，高效翻譯XBP－1蛋白，該蛋白促使伴侶蛋白Bip/GRP78基因表達上調(diào)，伴侶蛋白翻譯增加，從而引導蛋白質(zhì)正確折疊［6］。IRE1能夠利用酵母雙雜交介導ERS相關(guān)的促凋亡和抗凋亡信號，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激早期，PERK和ATF6被激活以拮抗ERS，IRE1一旦被激活，首先通過剪接 XBP－1誘導 UPR，隨后誘導P58IPK的表達恢復蛋白質(zhì)合成，使細胞恢復到正常狀態(tài)。但如果應激繼續(xù)加重，IRE1就會通過激活JNK激酶誘發(fā)細胞凋亡［7］。IRE1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應起始階段的感受蛋白，其表達水平的變化，在一定程度上反映了UPR和ERS的程度。

甲基強的松龍是一種合成的中效糖皮質(zhì)激素，是目前治療脊髓損傷的“金標準”。既往研究結(jié)果表明用大劑量甲基強的松龍在傷后8 h內(nèi)，首先以30 mg/kg靜脈內(nèi)快速沖擊，繼之以5.4 mg/(kg.h)維持23 h，可明顯改善患者運動和感覺功能。但受損8 h后，即使繼續(xù)給藥也不能逆轉(zhuǎn)損傷神經(jīng)元的變性［8］。甲基強的松龍阻止繼發(fā)性脊髓損傷發(fā)生的可能機制主要是:①逆轉(zhuǎn)細胞內(nèi)鈣離子聚集;②增加鈉和鉀離子依賴性ATP酶的活性;③抑制炎癥反應;④減輕水腫;⑤抑制血管活性、前列腺素活性，增加脊髓血流量;⑥抑制氧自由基及脂質(zhì)過氧化反應，穩(wěn)定細胞膜和溶酶體膜［9］。本實驗還發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后甲基強的松龍能夠降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)凋亡因子IRE1蛋白的表達，提示甲基強的松龍能夠拮抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡，但其通過怎樣的具體機制作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生尚不清楚。

本研究中筆者也發(fā)現(xiàn)凋亡細胞在空間和時相分布上也有特定的規(guī)律，空間上特征:①損傷區(qū)域附近有更多凋亡細胞，凋亡細胞數(shù)量遠遠高于原發(fā)損傷段;②凋亡細胞多以膠質(zhì)細胞為主，根據(jù)細胞的形態(tài)和分布區(qū)域分析，大多數(shù)為少突膠質(zhì)細胞;③白質(zhì)中的凋亡細胞數(shù)量多于灰質(zhì)。時相分布的特征主要為:①膠質(zhì)細胞在相對較長時間內(nèi)陸續(xù)凋亡，而神經(jīng)元則相對較早發(fā)生凋亡;②細胞凋亡現(xiàn)象在傷后8 h即可在損傷段被發(fā)現(xiàn)。筆者發(fā)現(xiàn)電針及甲基強的松龍治療組凋亡細胞數(shù)較模型組少，提示電針和甲基強的松龍可能是通過抑制細胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，減輕脊髓損傷所致的神經(jīng)功能的缺失。有學者［3］研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后第1 d、3 d、7 d、14 d在灰質(zhì)均可見 IRE1陽性細胞數(shù)和染色強度逐漸增高，并于術(shù)后14 d達鋒值，術(shù)后21 d、28 d下降較明顯。目前本實驗只探究37天內(nèi)細胞凋亡組織形態(tài)學以及IRE1蛋白的表達情況，而進一步探究針刺對于脊髓損傷后14 d及更長時間的作用情況是筆者未來研究的方向之一。

本研究基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激細胞凋亡探討夾脊電針的相關(guān)機制。在脊髓損傷后應用夾脊電針治療，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子IRE1的蛋白表達水平與模型組比較均不同程度降低，其作用優(yōu)于甲基強的松龍。結(jié)果表明，電針通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡因子，升高抗凋亡因子，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激細胞凋亡。

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