蔡聯(lián)輝，曾虹燕，蔡西玲，劉學(xué)英，譚奕哲

(湘潭大學(xué) 化工學(xué)院，湖南 湘潭，411105)

蓮子為睡蓮科植物蓮的種子，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)，且蓮子蛋白是氨基酸平衡較理想的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[1]。酶水解可改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)通過酶水解可制備營養(yǎng)價(jià)值更高和功能性質(zhì)更好的蛋白多肽等產(chǎn)品[2-3]。目前，蓮子蛋白的研究多停留在提取工藝和組成方面，很少見對蓮子蛋白酶水解及其水解動(dòng)力學(xué)的研究。根據(jù)酶水解原理及酶促動(dòng)力學(xué)理論，蛋白酶解是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過程，酶解分為底物分子擴(kuò)散到酶上和酶剪切底物分子，其反應(yīng)速率與底物的擴(kuò)散速率直接相關(guān), 強(qiáng)運(yùn)動(dòng)阻力會(huì)制約底物分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而影響反應(yīng)的速度，對酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響[4-7]。目前，人們蛋白酶解體系中擴(kuò)散現(xiàn)象的研究較少，有關(guān)構(gòu)建蛋白酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)往往僅以考察“反應(yīng)”這單因素，而忽略了底物大分子擴(kuò)散作用對反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響。要全面描述蛋白酶解歷程反應(yīng)行為，有必要引入擴(kuò)散因素，對其動(dòng)力學(xué)進(jìn)一步完善。在此，本文作者以蓮子蛋白為底物，考察其在木瓜蛋白酶作用下的反應(yīng)-擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)行為，分析擴(kuò)散現(xiàn)象對酶解反應(yīng)的影響，研究木瓜蛋白酶過程的擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性，建立相應(yīng)的水解擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，以便為蓮子蛋白酶解反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和蓮子蛋白的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

主要材料為：木瓜蛋白酶，食品級，80萬U/g，北京酶制劑廠生產(chǎn)；空心白蓮，湖南宏興隆湘蓮食品有限公司生產(chǎn)，于 37 ℃干燥，制成蓮子粉(粒徑為0.150 mm)。所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 蓮子蛋白提取及酶水解

蓮子粉用0.1 mol/L的NaCl于45 ℃的恒溫水浴鍋中提取1 h，提取液以轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心分離15 min，用0.5 mol/L的HCl 調(diào)上清液pH至4.2得蓮子蛋白液。

在一定酶質(zhì)量濃度下于 55 ℃水浴酶解特定質(zhì)量濃度的蓮子蛋白液，在水解過程中不斷滴加0.1 mol/L NaOH溶液以穩(wěn)定反應(yīng)體系pH至5.0。定時(shí)取樣，樣品于90 ℃下滅酶15 min，酸沉未水解蛋白，于轉(zhuǎn)速為4 000 r/min時(shí)離心分離15 min，得蛋白多肽的上清液，測定水解度。

1.3 蛋白質(zhì)含量的測定

參照GB 5497—85，采用凱式定氮法測量蛋白質(zhì)的含量(儀器為UV9100分光光度計(jì)，日立公司制造)。

1.4 水解度的測定

2 結(jié)果與討論

2.1 底物濃度對水解度的影響

在酶質(zhì)量濃度為0.5 g/L的條件下，考察不同蛋白濃度對酶解反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖1。從圖1可知：在水解時(shí)間相同時(shí)，隨著底物質(zhì)量濃度從4.68 g/L增加到27.26 g/L，水解度下降。這可能是隨著底物質(zhì)量濃度的升高，反應(yīng)體系黏度逐漸增大，底物蛋白分子和木瓜蛋白酶擴(kuò)散速度不斷減小，降低了底物與酶分子的碰撞概率，從而使水解度DH逐漸降低；另一方面，也可能是集聚于酶活性部位的底物蛋白增多，抑制了水解反應(yīng)，從而使水解度DH不斷降低。

圖1 底物質(zhì)量濃度不同時(shí)的水解時(shí)程曲線Fig.1 Time-course curves of protein hydrolysis at different substrate concentrations

2.2 初始酶質(zhì)量濃度對水解度的影響

在蛋白底物質(zhì)量濃度為13.63 g/L的條件下，考慮不同初始酶質(zhì)量濃度對水解度的影響，結(jié)果見圖 2。底物的水解度取決于酶的質(zhì)量濃度。從圖2可知：水解度隨著水解時(shí)間的延長而趨向穩(wěn)定, 初始酶質(zhì)量濃度不同時(shí), 平衡水解度不同, 平衡水解度隨初始酶質(zhì)量濃度的提高而提高。

2.3 水解速率與底物質(zhì)量濃度

假設(shè)木瓜蛋白酶恒溫控制水解動(dòng)力學(xué)遵循內(nèi)切酶限制水解動(dòng)力學(xué)歷程，據(jù)米氏方程，當(dāng)反應(yīng)體系酶用量與底物質(zhì)量濃度一致時(shí), 則在同一反應(yīng)條件下反應(yīng)速率應(yīng)相同。反應(yīng)速度r與底物質(zhì)量濃度ρ0的關(guān)系見圖3。由圖3可知：不同的蛋白底物質(zhì)量濃度的酶促反應(yīng)速率有較大差異；當(dāng)ρ0＜13.63 g/L時(shí)，隨底物質(zhì)量濃度的增大，反應(yīng)速率加快；當(dāng)ρ0＞13.63 g/L時(shí)，隨底物質(zhì)量濃度的增大，酶解速率逐漸下降。這說明當(dāng)ρ0超過13.63 g/L時(shí)，底物對木瓜蛋白酶水解蓮子蛋白有抑制作用。這可能是由于底物和酶分子形成了不具催化反應(yīng)活性不能分解為產(chǎn)物的死端復(fù)合物[8]，使酶解反應(yīng)的速度降低；若底物質(zhì)量濃度過高，則其反應(yīng)液黏度增高，底物擴(kuò)散到酶分子活性中心的阻力增大，其擴(kuò)散速率變小，存在底物的擴(kuò)散限制效應(yīng)，特別在酶催化活性高時(shí)，這種擴(kuò)散限制效更為明顯，從而使酶解反應(yīng)的速度降低。

圖2 不同酶質(zhì)量濃度時(shí)的水解時(shí)程曲線Fig.2 Time-course curve of protein hydrolysis at different enzyme mass concentrations

圖3 反應(yīng)速度r與底物質(zhì)量濃度ρ0的關(guān)系Fig.3 Relationship between reaction rate and substrate concentration

圖4 酶解反應(yīng)的L-B圖Fig.4 Lineweaver-Burk plot for enzymolysis

2.4 擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型

木瓜蛋白酶為專一性酶，根據(jù)中間產(chǎn)物理論，酶促反應(yīng)可按下列兩步進(jìn)行，即

式中：E為木瓜蛋白酶；S為底物；P為產(chǎn)物；k1，k2，k3和k4為速度常數(shù)。由于E+P形成ES的速度極慢，故k4可忽略不計(jì)。其反應(yīng)速率決定于不可逆步驟，即

式中：k3為酶失活常數(shù)。t為反應(yīng)時(shí)間；h為蛋白水解度；ρ(ES)為酶與底物結(jié)合物的質(zhì)量濃度。

考慮到蛋白酶在酶解過程中失活，其失活機(jī)制可簡述為

式中：k5為酶失活常數(shù)。其失活速率方程為

其中：ρ(E)為酶的質(zhì)量濃度。若存在底物的抑制，則酶解反應(yīng)簡述為

考慮蛋白質(zhì)單底物水解、蛋白酶失活和底物抑制因素，酶水解反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，水解度h與水解時(shí)間t有如下關(guān)系[9]：

由于動(dòng)力學(xué)方程式(3)未考慮底物和酶分子在反應(yīng)體系中的擴(kuò)散因素，也就是將酶水解的反應(yīng)時(shí)間tr等同于整體反應(yīng)時(shí)間t，當(dāng)反應(yīng)體系中底物和酶分子的擴(kuò)散作用不可忽略時(shí)，必須對動(dòng)力學(xué)方程(3)進(jìn)行修正。蓮子蛋白的酶解時(shí)間由底物和酶分子擴(kuò)散并相互接觸的時(shí)間td和酶水解底物的反應(yīng)時(shí)間tr構(gòu)成[10]，即反應(yīng)時(shí)間tr=t-td。此時(shí)，式(1)轉(zhuǎn)化為

底物擴(kuò)散系數(shù)與濃度存在指數(shù)函數(shù)關(guān)系[11-13]。同時(shí)，隨酶解反應(yīng)的進(jìn)行，體系中底物和酶分子擴(kuò)散并相互接觸的時(shí)間td也隨之增加，故td是酶解時(shí)間的函數(shù)。因此，td的表達(dá)式可設(shè)為

式中：kf為指前因子；w0為底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

將式(3)代入式(2) , 可得：

2.5 擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的確定

2.5.1ρ0和ρ1對參數(shù)b和c的影響

在溫度為 55 ℃、pH為 5.0、底物質(zhì)量濃度為4.68～27.26 g/L和酶起始質(zhì)量濃度為0.5～0.9 g/L的條件下，根據(jù)方程h=ln(1+bct)，對不同底物質(zhì)量濃度(圖 1)和不同初始酶質(zhì)量濃度(圖 2)試驗(yàn)中的蛋白水解度DH對時(shí)間t的關(guān)系進(jìn)行非線性回歸運(yùn)算, 可得該方程(6)中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)a和b，見表1。從表1可知：參數(shù)b和c隨ρ0增大而降低；c隨ρ1增大而增加，而b隨ρ1增大而減小。

2.5.2 擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的ks，kd及k3

當(dāng)存在底物抑制 (底物質(zhì)量濃度ρ0為13.63～27.26 g/L) 時(shí)，根據(jù)參數(shù)b和c的表達(dá)形式，以b-1-ρ0及cρ0(bρ1)-1-作圖，結(jié)果分別見圖 5(a)和 5(b)。利用線性回歸方法求出b-1-ρ0的關(guān)系式：

表1 蓮子蛋白酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù)b和cTable 1 Kinetic parameters b and c for hydrolysis of lotus seed protein

由b的表達(dá)式及圖5(a)可得：

由b和c的表達(dá)式及圖5(b)可得：

由式(7)和(8)解方程求得：k3=159.195 9 g/L；ks=197.988 4 g/L；kd=1.608 8g/(L·min)。

當(dāng)無底物抑制(底物濃度ρ0為4.68～13.63 g/L)時(shí)，由表1可知：動(dòng)力學(xué)參數(shù)b′在不同的初始底物質(zhì)量濃度下，其值相差很小，趨于常數(shù)0.248 3。因此，在恒溫水解反應(yīng)中，b′可以看作是常數(shù), 取其平均值。根據(jù)參數(shù)b和c的表達(dá)形式，以cρ′(bρ′)-1-作圖，結(jié)果見圖 5(b)。利用線性回歸方法求出cρ′(be′)-1-的 關(guān) 系 式cρ0′ (bρ1′)-1=493.695 1-378.467 3·，相關(guān)系數(shù)R2′=-0.991 4。由b′和c′的表達(dá)式及圖5(b)可得：kd′ =0.766 6g/(L·min)。

圖5 酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算Fig.5 Determination of kinetic constants

當(dāng)存在底物抑制時(shí)，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入擬合方程(6)，其b-1與ρ0以及cρ0(bρ1)-1與的比值具有很好的線性關(guān)系(見圖5(a)和(b))，其擬合系數(shù)R2的絕對值均大于 0.950 0，表明在底物質(zhì)量濃度ρ0為13.63～27.26 g/L時(shí)，木瓜蛋白酶酶解蓮子蛋白動(dòng)力學(xué)過程較好地吻合方程(6)，證明了擴(kuò)散-反應(yīng)模型的有效性；ks和k3相近，為同一數(shù)量級，說明底物抑制較易發(fā)生。故在酶解過程中，要控制好底物的質(zhì)量濃度，避免出現(xiàn)底物抑制。由動(dòng)力學(xué)常數(shù)計(jì)算的最適底物質(zhì)量濃度(=12.43g/L)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所得rmax的最適底物質(zhì)量濃度(見圖3，ρopt=13.63 g/L)接近，說明本文所建擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型 (方程(6))較合理。當(dāng)無底物抑制時(shí)，cρ′(bρ′)-1-的R2′為01-0.991 4，良好的線性關(guān)系證明了該擴(kuò)散-反應(yīng)模型的有效性。

由圖5以及b與c的表達(dá)式可求得酶解的擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型為

2.6 擴(kuò)散對酶解反應(yīng)速率的影響

酶對底物進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，底物必須從主體溶液傳遞到酶內(nèi)部的催化活性中心處。這種物質(zhì)傳遞過程包括分子擴(kuò)散和對流擴(kuò)散，其擴(kuò)散過程的速率在某些情況下可能會(huì)對反應(yīng)速率產(chǎn)生限制作用，特別是由于生物物質(zhì)在液體中的擴(kuò)散速率很小，當(dāng)酶的催化活性很高時(shí)，這種擴(kuò)散限制效應(yīng)會(huì)相當(dāng)明顯。定義一個(gè)無因次數(shù)群M為最大反應(yīng)速率/最大擴(kuò)散速率之比。當(dāng)M＜＜ 1時(shí)，酶最大催化反應(yīng)速率要大大慢于底物的擴(kuò)散速率，此時(shí)該反應(yīng)過程為反應(yīng)動(dòng)力學(xué)控制；當(dāng)M＞＞ 1時(shí)，底物的最大擴(kuò)散速率要大大慢于酶催化反應(yīng)速率，此時(shí)該反應(yīng)過程為傳質(zhì)擴(kuò)散控制。

在4.68≤ρ0＜13.63 g/L時(shí)，無底物抑制；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度由4.68 g/L逐漸增大到10.45 g/L時(shí)，擴(kuò)散速率kd由0.626 3 g/(L·min)逐漸變小到0.351 7 g/(L·min)，M由0.110 3逐漸增大到0.196 3；當(dāng)13.63≤ρ0≤27.26 g/L時(shí)，底物質(zhì)量濃度由13.63 g/L逐漸增大到27.26 g/L時(shí)，擴(kuò)散速率kd由 0.411 7 g/(L·min)逐漸變小到0.105 3 g/(L·min)，M由0.128 6逐漸增大到0.502 7。

當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度由4.68 g/L逐漸增大到27.26 g/L時(shí)，M由0.110 3逐漸增大到0.502 7，擴(kuò)散速率kd由0.626 3 g/(L·min)逐漸減小到 0.105 3 g/(L·min)，說明隨底物質(zhì)量濃度的增大，傳質(zhì)擴(kuò)散對水解反應(yīng)的影響逐漸增大。在本文實(shí)驗(yàn)底物濃度(4.68～27.26 g/L)范圍內(nèi)，并未出現(xiàn)M＞＞ 1 和M＜＜ 1 這 2 種極端情況，說明所研究的底物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的酶反應(yīng)速率是由反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和傳質(zhì)擴(kuò)散混合控制的，其擴(kuò)散因素是不能忽略的。目前，大多酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究并未考慮擴(kuò)散因素，要更準(zhǔn)確和全面地?cái)M合及預(yù)測酶解過程變化，建立擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型可能更接近實(shí)際情況。

2.7 動(dòng)力學(xué)模型擬合

根據(jù)酶解擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型的計(jì)算結(jié)果與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比，可以驗(yàn)證理論的動(dòng)力學(xué)模型對實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果的吻合程度，驗(yàn)證動(dòng)力學(xué)模型的實(shí)際應(yīng)用意義。

在 pH 為 5.0，溫度為 55 ℃，底物質(zhì)量濃度為4.68～27.26 g/L和酶起始質(zhì)量濃度為0.5～0.9 g/L的試驗(yàn)條件下，根據(jù)試驗(yàn)得出的水解度結(jié)果與其對應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型的計(jì)算結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見圖1和圖2。從圖1和圖2 可見：除個(gè)別點(diǎn)外，其余平均相對誤差均小于5%?？梢姡核⒌臄U(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型能更準(zhǔn)確地預(yù)測一定范圍內(nèi)不同底物的質(zhì)量濃度和酶質(zhì)量濃度，達(dá)到指定水解度所需反應(yīng)時(shí)間或不同時(shí)刻對應(yīng)的水解度，滿足蓮子蛋白水解度變化規(guī)律和特點(diǎn)，具有一定的通用性，這對蓮子蛋白的降解和蓮子蛋白肽的生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。

3 結(jié)論

(1) 用木瓜蛋白酶解蓮子蛋白動(dòng)力學(xué)過程在考慮擴(kuò)散因素對反應(yīng)動(dòng)力學(xué)影響的基礎(chǔ)上，經(jīng)過一系列假設(shè)和簡化，建立了木瓜蛋白酶解蓮子蛋白的擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。木瓜蛋白酶酶解蓮子蛋白在初始底物濃度4.68≤ρ0≤13.63 g/L時(shí)，符合無底物抑制擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型；在13.63 g/L≤ρ0≤27.26時(shí)，符合底物抑制擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。

(2) 基于對不同實(shí)驗(yàn)條件下水解曲線的分析，提出同時(shí)考慮蛋白質(zhì)單底物酶解、底物抑制作用和擴(kuò)散的反應(yīng)機(jī)理模型，構(gòu)建木瓜蛋白酶酶解蓮子蛋白的擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程：

由該動(dòng)力學(xué)模型所得結(jié)果與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合，實(shí)驗(yàn)擬合相對誤差小于 5%。酶反應(yīng)速率由反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和傳質(zhì)擴(kuò)散混合控制，所提出的擴(kuò)散-反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型能夠合理地描述和解釋酶法降解的過程，有助于認(rèn)識蓮子蛋白酶法降解機(jī)理，對蓮子蛋白肽的生產(chǎn)也具有指導(dǎo)作用。

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