韓 蓓，羅文娟，于 燕，胡森科，張瑞娟*

1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系;2陜西省營養(yǎng)與食品安全工程研究中心，西安 710061

多糖，也稱多聚糖(polysaccharide，PS)，是一大類在自然界中廣泛存在的生物體所產(chǎn)生的具有多種活性的生物高分子。多數(shù)細(xì)菌在生長過程中可向環(huán)境分泌多糖，稱為胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)，其具有可溶性、可降解性、對人和環(huán)境無毒等特點(diǎn)，并且具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抑菌等生理活性［1，2］。近年來，基于細(xì)菌胞外多糖的醫(yī)用價值和工業(yè)用途開發(fā)各種生物藥品、功能食品、食品添加劑、多糖疫苗等成為研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)室從水果樣品中分離出一株菠蘿泛菌Pantoea ananatis G-14，其高產(chǎn)胞外多糖。P.ananatis被認(rèn)為是一種可以引起多種植物病害的植物病原細(xì)菌，其EPS的合成與該菌對植物的侵襲相關(guān)，而該菌及其EPS對人、畜并未顯示出毒害作用［3］。本研究對P.ananatis G-14胞外多糖進(jìn)行了提取、分離，并對其體外抗氧化活性和抗腫瘤活性進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步分離新的天然抗氧化劑及抑腫瘤活性物質(zhì)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌及腫瘤細(xì)胞系

P.ananatis G-14為陜西省營養(yǎng)與食品安全工程研究中心微生物實(shí)驗(yàn)室分離菌株(GenBank 16s rRNA登錄號為JN974457)［4］，現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號為CCTCC M 2012107)。G-14的產(chǎn)多糖發(fā)酵培養(yǎng)基為1.5%蛋白胨，0.5%大豆胰蛋白胨，0.5%NaCl，1%葡萄糖)，培養(yǎng)條件為30℃，通氣培養(yǎng)。

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 G-14產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化

分別研究了發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH對G-14產(chǎn)胞外多糖的影響。基本培養(yǎng)條件為:搖瓶分批發(fā)酵，30℃，200 rpm通氣培養(yǎng)，產(chǎn)多糖發(fā)酵培養(yǎng)基(見1.1)，自然pH。

1.2.1 最適發(fā)酵時間

50 mL產(chǎn)多糖發(fā)酵培養(yǎng)基(自然pH=7.2)置于250 mL搖瓶中，30℃，200 rpm通氣培養(yǎng)G-14 96 h，其中每24 h取樣測定上清粗多糖濃度(采用苯酚-硫酸法測定［5］)以及細(xì)菌濃度OD600，確定胞外多糖峰值出現(xiàn)的發(fā)酵時間點(diǎn)。

1.2.2 最佳發(fā)酵溫度

50 mL產(chǎn)多糖發(fā)酵培養(yǎng)基(自然pH=7.2)置于250 mL 搖瓶中，分別在 20、25、30、37、40、45 ℃，200 rpm通氣培養(yǎng)G-14至1.2.1確定的最適發(fā)酵時間，取樣測定上清粗多糖濃度，確定胞外多糖峰值出現(xiàn)的發(fā)酵溫度。

1.2.3 培養(yǎng)基最適初始pH

50 mL產(chǎn)多糖發(fā)酵培養(yǎng)基置于250 mL搖瓶中，利用1M HCl或NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 至4.0、5.0、6.0、7.0、7.2、7.5、8.0、9.0，在 1.2.1 和 1.2.2 確定的最適發(fā)酵時間和最佳發(fā)酵溫度條件下培養(yǎng)G-14，確定胞外多糖峰值出現(xiàn)的培養(yǎng)劑最適初始pH。

1.3 胞外多糖的分離純化

G-14的過夜培養(yǎng)物以1%(V/V)轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(pH7.5)，30 ℃，200 rpm，通氣培養(yǎng)72 h。10000 rpm，4℃，5 min離心除去發(fā)酵液中的菌體，上清中加入3倍體積的95%的預(yù)冷乙醇過夜沉淀;10000 rpm，4℃，10 min離心收集多糖沉淀，加入ddH2O溶解多糖，1∶3(V/V)加入Sevage試劑，混勻離心除蛋白，此步驟重復(fù)3～5次;EPS溶液在ddH2O透析72 h，最后將透析好的EPS溶液制成凍干粉，室溫干燥保存［2］。

1.4 體外抗氧化活性測定

1.4.1 還原活性

準(zhǔn)確稱取20 mg EPS粉末，配置成5.0 mg/mL的EPS溶液。采用倍比稀釋法用雙蒸水將此EPS溶液稀釋成 5.0、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15 mg/mL。反應(yīng)體系包括1 mL不同濃度的EPS溶液，2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，充分混勻，50℃反應(yīng)20 min;再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，混勻，3000 rpm離心10 min，取上清2.5 mL，與2.5 mL 蒸餾水和 0.5 mL 0.1%FeCl3混勻，室溫反應(yīng)5 min，測OD700。以維生素C(Vc)做陽性對照，ddH2O做陰性對照。以O(shè)D700值表示還原力，OD700值越高，還原力越強(qiáng)［5］。

1.4.2 清除DPPH自由基活性

采用1.4.1所述方法配制不同濃度的EPS溶液。取2 mL 40 mg/L DPPH溶液，分別與2 mL不同濃度的EPS溶液混勻，空白對照組加入2 mL雙蒸水;充分混勻后，避光、室溫反應(yīng)30 min，測 OD517。以Vc做陽性對照，ddH2O做陰性對照。EPS清除DPPH自由基的能力由清除率反映，其計算公式如下，A0為空白對照的平均吸光度值，A1為樣品的平均吸光度值［5］。

1.4.3 清除羥自由基·OH活性

采用1.4.1所述方法配制不同濃度的EPS溶液。取2 mL EPS溶液，與2 mL 6 mM FeSO4溶液充分混勻，再分別加入2 mL 6 mM H2O2溶液，充分混勻，室溫反應(yīng)30 min，測OD510。以Vc做陽性對照，ddH2O做陰性對照。EPS清除羥自由基的能力的由清除率反映，其計算公式如下，A0為空白對照的平均吸光度值，A1為樣品的平均吸光度值［5］。

采用1.4.1所述方法配制不同濃度的EPS溶液。25℃水浴中預(yù)熱4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.2)，然后分別加入1 mL不同濃度的EPS溶液，0.4 mL 25 mM鄰苯三酚溶液，充分混勻;25℃水浴反應(yīng)5 min，加入8 mol/L的HCl 1 mL終止反應(yīng)，測OD299。以Vc做陽性對照，ddH2O做陰性對照。EPS清除超氧陰離子的能力的由清除率反映，其計算公式如下，A0為空白對照的平均吸光度值，A1為樣品的平均吸光度值［5］。

1.4.5 抑制脂質(zhì)過氧化活性

1∶40 稀釋的卵黃懸液 0.2 mL，25 mM Fe-7H2O 0.2 mL，5.0、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15 mg/mL EPS各0.1 mL，與1.5 mL PBS混勻，37 ℃水浴孵育15 min，加入0.5 mL 20% 三氯乙酸終止反應(yīng)。分別加入1.0 mL硫代巴比妥酸(TBA，0.8%)溶液，100℃水浴15 min，離心取上清測定 OD532。以ddH2O做陰性對照，樣品EPS對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制率(%)如下計算［6］。

1.5 體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖(MTT)實(shí)驗(yàn)

將生長狀態(tài)良好，于對數(shù)期生長的MCF-7細(xì)胞以2×104接種于96孔板，過夜培養(yǎng)。然后加入0.3、0.6、1.2、3.5、5.25、7 mg/mL EPS，將細(xì)胞置37℃、5%CO2中培養(yǎng)48 h，取出腫瘤細(xì)胞進(jìn)行MTT法檢測，每孔加入5 mg/mL MTT溶液(Fluka)20 μL，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出，離心去上清，每孔加 DMSO(Merck)100 μL，輕柔混勻 5 min，測定每孔培養(yǎng)物OD490，以無菌ddH2O代替EPS作為陰性對照。每組設(shè)5個平行孔，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。EPS對腫瘤細(xì)胞MCF-7的生長抑制率(%)=［(BA)/A×100%］，其中 A為 EPS樣品處理孔的OD490，B為陰性對照孔的

2 結(jié)果與討論

2.1 G-14產(chǎn)胞外多糖的最適發(fā)酵條件

一般來講，細(xì)菌生長量越大，其此生代謝產(chǎn)物的濃度也會提高，通過測定OD540和上清 胞外多糖濃度，繪制了G-14在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h內(nèi)的生長曲線與產(chǎn)多糖曲線(圖1A)。細(xì)菌細(xì)胞濃度峰值(OD600=2.8)和胞外多糖產(chǎn)量峰值(121 mg/L)出現(xiàn)的時間重合，都在72 h處，因此可初步確定P.ananatis G-14的產(chǎn)多糖發(fā)酵時間為72 h。該結(jié)果與Lee［7］報道的 Bacillus polymyxa KCTC 8648P 產(chǎn)胞外多糖，Raza［6］報道的 Paenibacillus polymyxa SQR-21產(chǎn)胞外多糖的情況一致。

接著我們繼續(xù)摸索了不同培養(yǎng)溫度下的細(xì)胞生長和產(chǎn)胞外多糖的情況，最大OD600值出現(xiàn)在30℃的發(fā)酵樣品中，且72 h發(fā)酵液中胞外多糖濃度曲線顯示，30℃的發(fā)酵樣品中的胞外多糖濃度最高，胞外多糖在30℃出現(xiàn)明顯的峰值(圖1B)。據(jù)此可進(jìn)一步確定P.ananatis G-14的產(chǎn)多糖發(fā)酵最適溫度為30℃。

培養(yǎng)基的初始pH對細(xì)胞的生長、營養(yǎng)成分的吸收、各種代謝產(chǎn)物的合成等均有重要的作用，對EPS的合成也不例外，細(xì)胞在最適的pH條件下才能迅速生長，并進(jìn)行相應(yīng)的代謝［1］。對G-14來講，產(chǎn)胞外多糖的最佳培養(yǎng)基的初始 pH為7.5(圖1C)，該結(jié)果與 Bacillus polymyxa KCTC 8648P產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)基的初始pH相同［13］。

2.2 G-14胞外多糖的分離純化

G-14菌株在產(chǎn)糖發(fā)酵固體培養(yǎng)基上的菌苔呈黃色、光滑、濕潤、飽滿(圖2)。

在最佳產(chǎn)糖發(fā)酵條件下(培養(yǎng)基初始pH7.5，30℃，200 rpm通氣培養(yǎng)72 h)進(jìn)行G-14的產(chǎn)糖發(fā)酵，發(fā)酵液72 h OD600為3.4，上清EPS濃度為129 mg/L。發(fā)酵液上清經(jīng)過濃縮、沉淀、除蛋白、透析后得到P.ananatis G-14胞外多糖粗提多糖干粉。

圖2 P.ananatis G-14在產(chǎn)多糖固體培養(yǎng)基上的生長Fig.2 The growth of P.ananatis G-14 on the solid medium for exopolysaccharide production

2.3 G-14胞外多糖的體外抗氧化作用

2.3.1 G-14胞外多糖的還原能力

抗氧化劑的抗氧化活性有不同的作用機(jī)制，包括抑制氧化作用鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的起始，分解過氧化物，清除自由基，作為金屬離子螯合劑等［8］。還原能力是衡量抗氧化能力的一個重要指標(biāo)，抗氧化劑通過自身給出電子來清除自由基，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。圖3可以看出，P.ananatis G-14胞外多糖具有一定的還原能力，且還原能力隨多糖濃度的增加而增加，還原能力與多糖濃度之間存在的顯著的量效關(guān)系，但是G-14多糖還原能力低于同濃度的Vc，5 mg/mL EPS的還原力為0.51，約為相同濃度Vc的還原力的1/4(2.1)。

圖3 P.ananatis G-14胞外多糖的體外還原能力，實(shí)線代表G-14胞外多糖，虛線代表VcFig.3 Reducing power of P.ananatis G-14 EPS.The solid line was G-14 EPS;the dotted line was Vc

2.3.2 清除DPPH自由基活性

DPPH·(1，1-二苯基-2-苦基肼自由基)是一種很穩(wěn)定的以氮原子為中心的自由基，帶有孤對電子，其乙醇溶液呈深紫色并在517 nm處有強(qiáng)吸收，氫基供體或其它電子供體(比如胞外多糖羥基上的氫)，可與DPPH·單電子配對而使其深紫色消失或變淺，并可通過測定吸光度得減弱程度評價抗氧化劑得活性［8］。隨著多糖濃度的增加，其對DPPH·的清除能力也逐漸在增強(qiáng)(表1)，在0.15 mg/mL時，EPS對DPPH·的清除率僅為5%，2.5 mg/mL時，清除率達(dá)28%，在5 mg/mL時，清除率達(dá)48%，對自由基的清除效果表現(xiàn)出濃度依賴性，且這種依賴性在EPS濃度低于2.5 mg/mL時尤為顯著。

2.3.3 G-14胞外多糖清除羥自由基·OH活性

羥基自由基(·OH)被公認(rèn)是生物系統(tǒng)中最具活性的活性氧化物，能導(dǎo)致生物體內(nèi)DNA，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化等的不可逆損傷。羥自由基的有效清除程度可以反映機(jī)體抵御疾病的能力。P.ananatis G-14胞外多糖對羥基自由基有一定的清除作用(表1)，5.0、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15 mg/mL EPS 作用下，反應(yīng)體系中羥基自由基清除率分別為60.4%、38.7%、20.8%、10.5%、8.0%和5.7%，EPS 對羥基自由基清除率具有顯著的濃度依賴性。目前對于胞外多糖清除羥基自由基的機(jī)制還不是非常清楚，有研究稱其可能與O-H鍵的解離能有關(guān)［9］。

2.3.5 G-14胞外多糖抑制脂質(zhì)過氧化活性

脂質(zhì)過氧化是機(jī)體產(chǎn)生的自由基對機(jī)體造成損傷的重要途徑之一，該過程可直接干擾和破壞膜的生物功能，許多導(dǎo)致羥自由基增多的因素、紫外輻射都會誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而誘發(fā)一系列疾病［1］。以卵黃脂蛋白為反應(yīng)底物的檢測體系主要是通過檢測脂質(zhì)過氧化中間產(chǎn)物MDA的水平來評價脂質(zhì)過氧化程度［11］，表 1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P.ananatis G-14胞外多糖具有較高的脂質(zhì)過氧化抑制作用，從0.15 mg/mL到0.6 mg/mL時，脂質(zhì)過氧化抑制作用隨多糖的濃度增加而顯著增加，當(dāng)多糖濃度高于1.25 mg/mL時，抑制作用趨于平穩(wěn)，在5 mg/mL時，抑制 作用可達(dá)35.8%。

表1 P.ananatis G-14胞外多糖的體外抗氧化活性Table 1 In vitro antioxidant activity of P.ananatis G-14 EPS

2.4 G-14胞外多糖對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用

近年來有很多研究證實(shí)細(xì)菌的胞外多糖對人腫瘤細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用［2］，因此越來越多的研究集中在這類天然物質(zhì)中獲取抗腫瘤成分。本研究以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為目標(biāo)，初步檢測了不同濃度的P.ananatis G-14粗提胞外多糖對其增殖的抑制作用，結(jié)果見圖4。G-14的EPS對MCF-7增殖具有一定的抑制作用，而且抑制作用在0.3～7 mg/mL的EPS作用濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出濃度相關(guān)性，其最高抑制率為69%。大量的體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)證明多糖主要通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)來抑制動物的腫瘤模型，有研究推測細(xì)菌的胞外多糖可能對免疫細(xì)胞表面受體具有特異的親和性，從而表現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，而非直接的細(xì)胞毒性［11］。目前對多糖結(jié)構(gòu)的研究多集中在初級結(jié)構(gòu)，對其空間構(gòu)象等的結(jié)構(gòu)測試較少，因此就多糖抗腫瘤活性而言，需要深入研究研究多糖的抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系，并通過分子修飾等提高其活性，對該類天然物質(zhì)充分利用，開發(fā)出新型抗腫瘤藥物。

圖4 P.ananatis G-14胞外多糖對腫瘤細(xì)胞MCF-7增殖的濃度依賴性抑制作用Fig.4 Dose-dependent effect of P.ananatis G-14 EPS on the growth of MCF-7

3 結(jié)論

綜上可知，P.ananatis G-14粗提胞外多糖具有較明顯的體外抗氧化活性，尤其是清除DPPH自由基和羥自由基，同時該胞外多糖對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖具有顯著的抑制作用，今后有必要對P.ananatis G-14粗提胞外多糖進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，獲得有效活性的物質(zhì)，并深入研究其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)理，為拓展新的抗腫瘤藥物的范圍提出新的研究思路。

1 Shih IL.Microbial exo-polysaccharides for biomedical applications.Mini-Rev Med Chem，2010，10:1345-1355.

2 Zhang M，Chen H，Huang J，et al.Effect of Lycium barbarum polysaccharide on human hepatoma QGY7703 cells:Inhibition of proliferation and induction of apoptosis.Life Sci，2005，76:2115-2124.

3 Coutinho TA，Venter SN.Pantoea ananatis:an unconventional plant pathogen.Mol Plant Pathol，2009，10:325-335.

4 Han B(韓蓓)，Liang H(梁歡)，F(xiàn)u GM(付桂明)，et al.Antibiotic resistance analysis and the AR gene transfer in non-pathogens in isolated from ready-to-eat food.Chin J Food Hygiene(中國食品衛(wèi)生雜志)，2012，24:412-416.

5 Xu CL(徐春蘭)，Qin CG(欽傳光)，Niu WN(牛衛(wèi)寧)，et al.Antioxidative activity of exopolysaccharide produced by Enterobacter cloacae Z0206.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2010，22:1098-1102.

6 Raza W，Makeen K，Wang Y，et al.Optimization，purification，characterization and antioxidant activity of an extracellular polysaccharide produced by Paenibacillus polymyxa SQR-21.Bioresour Technol，2011，102:6095-6103.

7 Lee IY，Seo WT，Kim GJ，et al.Optimization of fermentation conditions for production of exopolysaccharide by Bacillus polymyxa.Bioprocess Eng，1997，16:71-75.

8 Liu L，Luo JG，Ye H，et al.Preparation，antioxidant and antitumor activities in vitro of different derivatives of levan from endophytic bacterium Paenibacillu polymyxa EJS-3.Food Chem Toxicol，2012，50:767-772.

9 Tsiapali E，Whaley S，Kalbfleisch J，et al.Glucans exhibit weak antioxidant activity，but stimulate macrophage free radical activity.Free Radic Bio Med，2001，30:393-402.

10 Xu RH，Shang N，Li PL.In vitro and in vivo antioxidant activity of exopolysaccharide fractions from Bifidobacterium animalis RH.Anaerobe，2011，17:226-231.

11 Rice PJ，Kelley JL，Kogan G，et al.Human monocyte scavenger receptors are pattern recognition receptors for(1--＞3)-beta-D-glucans.J Leukoc Biol，2002，72:140-146.