郭真真 吳毅 賈杰 吳志遠 李明芬

1990年Kitagawa等［1］發(fā)現(xiàn)對腦組織進行短暫缺血預處理后，可以產(chǎn)生“腦缺血耐受(brain ischemic tolerance)”。隨后研究發(fā)現(xiàn)可誘導腦缺血耐受的預處理方法有缺氧/高氧［2］、藥物［3］、低溫［4］、運動［5］、缺血［6］和電針［7-15］等多種。

電針作為一種對機體刺激較小且行之有效的預處理方法，得到了研究人員的重視，并取得了很大進展。研究證明，電針預處理可明顯減少缺血區(qū)腦細胞的凋亡［16］，減小腦梗死體積，顯著減輕大鼠的神經(jīng)功能損害程度［17］，并能改善大鼠缺血后突觸的超微結(jié)構(gòu)從而影響突觸的可塑性［18］。相應的機制研究表明，電針預處理可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元NMDA受體2A和2B的表達［19-20］，而重復電針預處理可增加內(nèi)源性大麻素及其受體［21］;Davies 等［22］及 Silkis 等［23］研究表明，大麻素與GABA、谷氨酸(glutamate，Glu)相互作用而調(diào)節(jié) γ-氨基丁酸(GABA)、Glu的釋放。

Glu是腦內(nèi)主要的興奮性氨基酸(EAA)，對腦缺血神經(jīng)細胞具有興奮性毒性作用。郭景春等［24-25］證實電針可抑制細胞外興奮性氨基酸的過量堆積。GABA是腦內(nèi)的主要抑制性氨基酸，有證據(jù)表明［26-27］，GABA可能通過超極化神經(jīng)元膜電位并抑制Glu能的遞質(zhì)釋放而對抗腦缺血時Glu的神經(jīng)毒作用。電針預處理對腦缺血的腦保護作用機制是否與Glu和GABA有關，尚未檢索到相關報道。因此，本實驗擬通過檢測電針預處理的腦缺血大鼠紋狀體內(nèi)Glu和GABA的動態(tài)變化，探討電針預處理對腦缺血再灌注損傷的保護機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組 將18只2～3月齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(清潔級，體質(zhì)量250～300 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供)隨機分為3組:假手術(shù)組、缺血組和電針預處理組，每組6只。

1.2 電針預處理 在大鼠清醒狀態(tài)下，用自備繩子將大鼠四肢固定在自制木板上，參照華興邦大鼠穴位圖譜，選取督脈經(jīng)穴百會(GV20)、大椎(GV14)兩穴?！鞍贂蔽挥陧敼钦?，“大椎”在第7頸椎與第1胸椎間，背部正中。以0.5寸毫針向前平刺百會約3 mm，斜刺大椎約10 mm，在兩穴上接電針刺激儀形成閉合電流環(huán)路。電流強度以大鼠耳朵微顫為穴位刺激有效指標，疏密波(2/15 Hz)，刺激 30 min，1 次/d，共 5 d。假手術(shù)組和缺血組無電針治療。

1.3 微透析留置管的植入及大腦中動脈缺血(MCAO)模型的建立 電針預處理結(jié)束后第2天，用10%的水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠;將大鼠固定于立體定位儀上，切開頭皮，暴露顱骨;于坐標為前囟向尾側(cè)4.6 mm，中線偏外側(cè)4 mm，深3.0 mm處鉆2 mm大小的孔，植入一自制不銹鋼留置管于大鼠紋狀體區(qū)，并用牙托粉固定。把植入留置管的大鼠仰臥位放在頭下方有一直徑為2 cm大小孔洞的木板上(防止留置的透析管脫落)。缺血組和電針預處理組參照Longa法制備大鼠中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion)模型［28］。假手術(shù)組只分離頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，而不結(jié)扎和放置線栓。

1.4 微透析采樣 以人工腦脊液作為腦內(nèi)微透析灌流液［29］，用MD21001型針管式微量注射泵進樣。大鼠麻醉后取俯臥位，頭水平位固定在立體定位儀上并在麻醉狀態(tài)下取樣:(1)置入微透析探針:把平衡好的微透析探針插入已埋好留置管的大鼠腦內(nèi)，將微透析探頭(有效透析膜長度4 mm，MAB6.14.4探針，Stainless Steel)經(jīng)留置管插入腦內(nèi)，入口端通過塑料導管與微透析泵(MD-0100，bioanalytical system，USA)的注射器相連，出口端通過導管連接0.5 ml離心管，以收集透析液用于高效液相測定。(2)收集流出液:將平衡好的微透析探針插入已埋好留置管的大鼠腦內(nèi)，流速為1 μl/min平衡90 min，收集所有流出液于一個微量管里，繼續(xù)平衡30 min，收集所有流出液于另一微量管里。(3)收集對照液:維持流速2 μl/min在紋狀體區(qū)進行微透析，測定微透析液中氨基酸含量的變化。每10 min收集1管透析液，共收集20 ml。分別在缺血前，插入線栓后 40、80、120 min，再灌注后 40、80、120、160、200、240 min 時收集透析液，整個過程共收集10管透析液。動物實驗結(jié)束后用高效液相色譜(HPLC)-熒光檢測法測定透析液中的Glu和GABA變化。

1.5 Glu和GABA遞質(zhì)的測定 參考顧擁軍等［29］的方法，用高絲氨酸作內(nèi)標，采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生法行高效液相色譜分析。用保留時間做定性分析，峰面積內(nèi)標法做定量分析。

1.6 神經(jīng)行為學評分 在缺血再灌注后24 h、處死大鼠之前對其進行神經(jīng)行為學評分，參照Zea-Longa五分制評分法:0分為無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀;1分為不能完全伸展對側(cè)前爪;2分為爬行時轉(zhuǎn)圈;3分為向?qū)?cè)傾倒;4分為不能自行行走，意識喪失。評分為1～3分的為造模成功，并選入相應組別。

1.7 TTC染色 再灌注24 h神經(jīng)功能損害評估完成后，立即給予過量的水合氯醛處死大鼠。迅速斷頭取腦，將腦放入-20℃冰箱中約15 min，然后用刀片從大腦額極至枕極連續(xù)冠狀位切片5片，每片厚約2.5 mm，把腦片浸入到2%TTC磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4)，并用錫箔紙避光染色30 min。染色結(jié)束后，電針預處理組和缺血組可以看到梗死區(qū)域，而假手術(shù)組中沒有見到梗死區(qū)。用數(shù)碼相機拍照腦片，然后計算腦梗死體積。每層腦片的梗死面積乘以腦片厚度就是該層腦片的梗死體積，5層梗死體積之和就是總梗死體積。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，整體比較先采用重復測量方差分析，再按時間點分層采用單因素方差分析或t檢驗進行組別間比較，按組別分層采用重復測量方差分析進行時間點間比較，具體時間點兩兩比較采用Bonferroni檢驗。組間兩兩比較采用Tukey法。

2 結(jié)果

2.1 Glu水平比較 假手術(shù)組缺血及再灌注各時間點與缺血前比較均無顯著性差異(P＞0.05)。缺血組大部分時間點(除外再灌注80 min和240 min)與缺血前比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.01);與缺血前水平相比，Glu水平在缺血40 min開始升高(P＜0.01)，80 min升高到峰值(P＜0.01)，120 min仍保持較高水平(P＜0.01)。再灌注后開始下降，再灌注80 min時下降至正常水平，至120 min時發(fā)生二次升高(P＜0.01)，160 min時達二次升高高峰(P＜0.01)。200 min后又降至正常(P＜0.01)，直至240 min一直保持正常水平。電針預處理組缺血及再灌注各時間點Glu水平與缺血前比較差異趨勢與缺血組基本一致:缺血開始先迅速升高，直至40 min時達到最高水平(P＜0.01)，80 min(P ＜0.01)、120 min(P ＜0.01)仍處于較高水平;再灌注時開始下降，到80 min時處于正常水平，然后開始回升，160 min升至一個小高峰(P＜0.01)，然后又開始下降，直至240 min再次降至正常水平。

組間比較結(jié)果顯示:除再灌注80 min和240 min外，缺血組大部分時間點與假手術(shù)組相應時間點比較有顯著升高(P＜0.01);除再灌注80 min和240 min外，電針預處理組大部分時間點與假手術(shù)組相應時間點比較有顯著升高(P＜0.01)，電針預處理組的Glu水平在缺血40、80、120 min和再灌注后120、160 min等時間點與缺血組相應時間點比較有顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1 清醒大鼠腦缺血再灌注期間紋狀體透析液中Glu水平的變化(±s，μmol/L)

表1 清醒大鼠腦缺血再灌注期間紋狀體透析液中Glu水平的變化(±s，μmol/L)

注:與缺血前比較，＊＊P＜0.01;與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01;與缺血組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

時間 假手術(shù)組 缺血組 電針預處理組缺血前3.60±0.69 3.62±0.80 3.60±0.71缺血時間 40 min 3.62±0.93 28.23±5.85＊＊△△ 22.66±5.13＊＊△△#80 min 3.80±0.88 34.02 ±7.03＊＊△△ 17.83 ±3.87＊＊△△##120 min 3.92±0.89 32.41 ±5.87＊＊△△ 19.12 ±3.95＊＊△△##再灌注時間 40 min 3.58±1.28 12.12±7.50＊＊△△ 10.28±3.41＊＊△△80 min 3.17±0.95 3.55±0.77 3.51±1.07120 min 3.24±0.77 8.76 ±3.04＊＊△△ 5.64 ±1.62＊＊△△#160 min 3.16±0.86 13.22 ±4.13＊＊△△ 5.86 ±1.60＊＊△△##200 min 3.20±0.97 5.05±1.22＊＊△△ 5.69±1.02＊＊△△240 min 3.32±0.71 3.70±1.30 3.64±0.79

2.2 GABA水平比較 假手術(shù)組缺血及再灌注各時 間點與缺血前比較均無顯著性差異(P＞0.05)。缺血組各時間點與缺血前比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01);缺血40 min開始升高(P＜0.01)，120 min升高到峰值(P＜0.01)，再灌注后開始下降，下降至再灌注40 min速度較快(P＜0.01)，之后一直到再灌注240 min呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(P＜0.01)。電針預處理組缺血及再灌注各時間點GABA水平與缺血前比較差異趨勢與缺血組基本一致:缺血開始先迅速升高(P＜0.01)直至120 min時達到最高水平;再灌注后開始下降，下降至再灌注40 min速度較快(P＜0.01)，之后一直到再灌注240 min呈現(xiàn)較慢下降趨勢(P＜0.01)。

組間比較結(jié)果顯示:缺血組各時間點與假手術(shù)組相應時間點比較有顯著升高(P＜0.01);電針預處理組各時間點與假手術(shù)組相應時間點比較有顯著升高(P＜0.01)，電針預處理組缺血40、80、120 min和再灌后160、200 min與缺血組相應時間點比較有顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

表2 清醒大鼠腦缺血再灌注期間紋狀體透析液中GABA的變化(±s，μmol/L)

表2 清醒大鼠腦缺血再灌注期間紋狀體透析液中GABA的變化(±s，μmol/L)

注:與缺血前比較，＊＊P＜0.01;與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01;與缺血組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.3 神經(jīng)行為學評分比較 假手術(shù)組評分為0分，缺血組為(3.17±0.41)分，電針預處理組為(2.17±0.41)分，各組之間有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，電針預處理組的行為學評分明顯低于缺血組(P＜0.01)。

2.4 各組大鼠腦梗死體積比較 采用單因素方差分析對各組缺血24 h腦梗死體積進行分析。由圖1可知，缺血組的腦梗死體積最大［(158.67±12.86)mm3］，電針預處理組腦梗死體積次之［(118.83±26.77)mm3］，假手術(shù)組則沒有發(fā)生腦梗死。電針預處理組的腦梗死體積小于缺血組腦梗死體積(P＜0.01)，說明電針預處理能夠明顯減小大鼠腦梗死體積。這與神經(jīng)功能損害評估的結(jié)果是一致的。

圖1 各組大鼠腦組織梗死體積比較

3 討論

EAA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，包括 Glu、天冬氨酸(Asp)等。1971 年 Olney［30-31］首次提出“興奮毒(excitotoxicity)”，他觀察到全身應用Glu可導致腦內(nèi)神經(jīng)元的退行性病變。后來大量研究表明［32-35］，腦缺血時細胞外液EAA增高，特別是EAA中的Glu增高更為顯著，Glu的大量堆積使神經(jīng)元持續(xù)去極化，增加了神經(jīng)元內(nèi)Glu的大量釋放。有證據(jù)表明［36］，一些對缺血再灌注損傷具有腦保護作用的藥物可能是通過降低細胞外液Glu濃度、抑制Glu受體的表達從而降低Glu的興奮毒作用而實現(xiàn)的。也有研究證實，采取一定的預干預措施誘導的腦保護作用可能是通過降低Glu濃度而實現(xiàn)的［5］。GABA是腦內(nèi)的主要抑制性氨基酸，在腦缺血時可能通過對抗Glu的興奮毒作用而起到腦保護效應，該效應通過激活GABA受體復合物來增加細胞外液中GABA濃度，從而導致跨過突觸后膜的氯離子的流動增加，減輕腦缺血產(chǎn)生的損傷作用［37］。近年來已有學者將GABA作為腦缺血的一種治療藥物來研究，并取得了一定成果。

腦缺血耐受的發(fā)現(xiàn)，為研究內(nèi)源性腦保護作用機制提供了新的思路，而電針作為一種刺激性小且行之有效的誘導腦缺血耐受的方法，更成為人們關注的焦點。電針預處理誘導腦缺血耐受的機制還不是很確切，歸納起來主要有以下幾方面:(1)針刺預處理后能夠使低氧誘導因子(HIF-1α)表達增加，是防止腦組織進一步缺血壞死的代償性反應［8］;(2)針刺預處理可以使腦組織內(nèi)腺苷(ADO)含量增高，ADO可使K+-ATP通道開放提前或加強，從而限制Ca2+內(nèi)流和興奮性氨基酸的釋放，繼而穩(wěn)定了神經(jīng)細胞的膜電位，使腦的能量代謝降低，從而使腦組織產(chǎn)生對氧和能量供應障礙的耐受性［9］;(3)電針預處理可誘導海馬 CA1區(qū)HSP70mRNA及 HSP70的表達增強，提示HSP70 mRNA及HSP70的表達與針刺預處理誘導的腦缺血耐受可能有關［10］;路志紅等［11］研究發(fā)現(xiàn)電針預處理百會穴后，大腦皮質(zhì)缺血區(qū)周圍HSP70的表達，同樣提示電針預處理誘導的腦缺血耐受與大腦皮質(zhì)缺血區(qū)周圍HSP70表達增強有關;(4)即早基因c-fos及c-fos蛋白是在受到胞外刺激后最先表達的一組基因，是聯(lián)系細胞生化改變與細胞最終刺激發(fā)生特異性反應的中介物。孫忠人等［12］研究指出針刺預處理可上調(diào)海馬CA1區(qū)c-fos mRNA及c-fos蛋白的表達，認為電針預處理誘導的腦缺血耐受機制可能與海馬CA1區(qū)c-fos mRNA表達有關。Bcl-2癌基因是細胞凋亡的重要抑制基因，研究指出，針刺預處理可誘導海馬CA1區(qū)Bcl-2 mRNA的表達，表明電針預處理誘導的腦缺血耐受機制可能與海馬CA1區(qū)Bcl-2表達有關［13］;(5)白細胞介素類和腫瘤壞死因子是體內(nèi)分泌的具有調(diào)節(jié)多種細胞的一類活性物質(zhì)，腦缺血區(qū)產(chǎn)生的炎性細胞因子可介導炎癥級聯(lián)反應，加重腦缺血損傷。王軍等［14］研究發(fā)現(xiàn)電針預處理誘導的腦缺血耐受機制可能與降低炎性細胞因子含量及阻斷炎癥級聯(lián)反應有關。(6)阿片受體可能參與電針預處理誘導的腦缺血耐受機制［15］。

本實驗測定了電針預處理對腦缺血再灌注大鼠腦紋狀體內(nèi)Glu和GABA水平的動態(tài)變化，結(jié)果顯示，在缺血大鼠Glu動態(tài)變化的第一個峰值(缺血80 min時)和再灌注后峰值(再灌注160 min時)的2個時間點，電針預處理后Glu水平均顯著下調(diào)。與Glu變化趨勢相似，在GABA動態(tài)變化的第一個峰值(缺血120 min時)和再灌注后160、200 min的3個時間點，電針預處理后GABA水平均顯著上調(diào)。本實驗也測定了各組大鼠缺血再灌注后腦梗死體積的變化及缺血再灌注24 h后神經(jīng)行為學評分，結(jié)果顯示電針預處理組的腦梗死體積小于缺血組的腦梗死體積，神經(jīng)行為學評分低于缺血組。以上結(jié)果表明電針預處理誘導腦缺血耐受的保護作用可能與其下調(diào)腦缺血灌注后Glu的升高及上調(diào)GABA濃度有關，為電針預處理誘導腦缺血耐受的機制研究提供了新的可能性和關注。

本實驗初步探討了電針預處理對大鼠腦缺血再灌注期間Glu和GABA濃度水平的影響，推測電針預處理可能通過調(diào)整Glu和GABA濃度水平變化誘導缺血耐受的機制，為臨床上應用電針預處理誘導腦保護作用提供了更有利的依據(jù)。但是電針預處理誘導腦缺血耐受的機制非常復雜，本實驗也只是關注了其中的一個可能性，其確切機制還有待進一步探討，電針預處理通過調(diào)整Glu和GABA濃度水平變化誘導缺血耐受更深層次的機制也有待進一步完善。

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