劉利平，申利英，常 春

(鄭州大學化工與能源學院，河南鄭州450001)

0 引言

能源短缺與環(huán)境污染，使新型生物能源的開發(fā)勢在必行.丁醇因其具有能量密度高、易與汽油混合等特點，而成為替代石油的重要選擇［1］.秸稈是地球上最豐富廉價的資源，以秸稈為原料制備生物丁醇在解決糧食、能源、環(huán)境污染等問題中具有重要的作用.

微生物無法直接利用秸稈為底物進行丁醇發(fā)酵，需將其水解產(chǎn)生葡萄糖、木糖等單糖后再用于丁醇發(fā)酵［2］.而水解后還原糖含量直接影響到丁醇的產(chǎn)量.但目前，對經(jīng)蒸汽爆破預處理的玉米秸稈為原料，進行糖化和丁醇發(fā)酵工藝研究的報道較少.李冬敏等［3］用汽爆玉米秸稈進行丁醇發(fā)酵，丁醇濃度達到了6.52 g/L.其丁醇含量較低，難以滿足規(guī)模化應用的條件.因此，本研究嘗試首先通過對汽爆玉米秸稈的糖化工藝進行考察，篩選出較佳的糖化工藝，并在此基礎上，分別對溫度、pH值、底物濃度、纖維素酶用量、菌種種齡及接種量、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵時間8個方面進行丁醇發(fā)酵工藝條件的試驗研究，得出汽爆玉米秸稈發(fā)酵丁醇的優(yōu)化工藝，為進一步的放大試驗研究提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetbutylicum ZZU-01):鄭州大學生化中心保藏;種子培養(yǎng)基:5%玉米醪;種子液活化:取一玉米醪儲存的試管菌種，沸水浴中處理90 s.然后在厭氧操作臺上(YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠)接種于5%玉米醪培養(yǎng)基，活化至對數(shù)期;纖維素酶:濾紙酶活力110 IU/mL;汽爆玉米秸稈:將玉米秸稈切至3～4 cm長，于1.5 MPa，205℃條件下汽爆處理8 min，汽爆處理后秸稈經(jīng)水洗脫毒并于80℃干燥恒重后，保藏待用;酶解液的制備:取一定量烘干的秸稈于錐形瓶中，加自來水，使底物質(zhì)量分數(shù)為15%.然后按照糖化工藝設計的條件加入纖維素酶(30 IU/g)，木聚糖酶(200 IU/g)，Tween-20(質(zhì)量分數(shù)為0.15%)，調(diào)pH為4.8，于50℃，150 r/min下反應一定時間后，離心取上清液.

1.2 糖化工藝設計

以蒸汽爆破預處理的玉米秸稈為原料，共進行了6種不同的秸稈糖化發(fā)酵丁醇工藝研究(稱為糖化工藝Ⅰ～Ⅵ).分別對比了汽爆玉米秸稈經(jīng)6種糖化工藝后的丁醇發(fā)酵結(jié)果.不同糖化方法的具體工藝為

糖化工藝Ⅰ:將纖維素酶一次性加入，糖化48 h;

糖化工藝Ⅱ:首先加入纖維素酶量的1/2，反應24 h后再加入1/2纖維素酶，共糖化48 h;

糖化工藝Ⅲ:將纖維素酶分成3等份，首先加入纖維素酶量的1/3，每隔6 h加一次纖維素酶，共糖化24 h;

糖化工藝Ⅳ:纖維素酶加入法與糖化工藝Ⅲ相同，但糖化時間延至48 h;

糖化工藝Ⅴ:首先加入纖維素酶量的1/3，反應24 h后，再加入1/3纖維素酶，剩下的纖維素酶再隔12 h加入，共糖化48 h;

糖化工藝Ⅵ:初始底物體質(zhì)量分數(shù)為15%，加入相應量的纖維素酶，反應24 h，每隔12 h，補一次原料，并且加入相應量的纖維素酶，共糖化48 h.

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

發(fā)酵培養(yǎng)基:秸稈酶解上清液1 L，酵母抽提物 1 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，(NH4)2SO45 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，尿素 2 g，CaCO35 g［3-4］.pH7.0，121 ℃，滅菌 20 min.除了考察培養(yǎng)基的影響因素外，其他試驗中的發(fā)酵培養(yǎng)基均采用以上基礎培養(yǎng)基.

發(fā)酵方法:將活化24 h的種子液，按體積分數(shù)為5%接種量進行接種，首先采用35℃，厭氧發(fā)酵72 h的條件，考察不同糖化工藝對丁醇發(fā)酵的影響.在此基礎上，對丁醇發(fā)酵的溫度、底物濃度、纖維素酶的用量、接種量和發(fā)酵時間進行了單因素試驗;對培養(yǎng)基酵母抽提物，KH2PO4，MgSO4·7H2O，(NH4)2SO4，F(xiàn)eSO4·7H2O，尿素和CaCO3進行了L32(74)正交試驗.在優(yōu)化的基礎上，對發(fā)酵后的丁醇產(chǎn)量進行了考察.

1.4 分析方法

(1)秸稈成分測定:采用質(zhì)量減重法［5］.

測得汽爆玉米秸稈主要成分為:纖維素的質(zhì)量分數(shù)為33.68%;半纖維素的質(zhì)量分數(shù)為7.29%;木質(zhì)素的質(zhì)量分數(shù)為22.31%.

(2)還原糖的測定:DNS 法［6］.

(3)溶劑的測定:氣相色譜法［7］.

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 糖化工藝對丁醇發(fā)酵的影響

根據(jù)1.2節(jié)的試驗設計，以還原糖含量和發(fā)酵丁醇濃度為考察目標，試驗結(jié)果如表1所示.

表1結(jié)果表明，糖化工藝Ⅵ的還原糖含量最高，為48.77 g/L，但丁醇含量僅有4.01 g/L，這可能是因為分批補料糖化使底物濃度增加的同時，也增加了抑制劑的濃度，嚴重抑制了丁醇發(fā)酵.糖化工藝Ⅰ與Ⅱ相比較，可知分步酶解要比一步酶解得到的還原糖含量高，還原糖含量的增加，也使得后續(xù)的丁醇發(fā)酵的濃度升高.以上結(jié)果表明，多步糖化和適當?shù)奶腔瘯r間能夠更充分地酶解纖維素，提高還原糖的含量，從而提高后續(xù)的丁醇發(fā)酵濃度.糖化工藝Ⅴ的丁醇產(chǎn)量達到了7.44 g/L，高于其它5種糖化發(fā)酵的丁醇產(chǎn)量，因此糖化工藝Ⅴ是汽爆玉米秸稈糖化發(fā)酵丁醇工藝中較優(yōu)的工藝路線.下面在糖化工藝Ⅴ的基礎上，進一步優(yōu)化丁醇發(fā)酵的工藝條件.

表1 不同糖化發(fā)酵試驗結(jié)果Tab.1 Fermentative results of different saccharification

2.2 丁醇發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 溫度對發(fā)酵的影響

本研究以得到最高的丁醇濃度為考察目標，首先對溫度的影響進行考察.試驗條件為:底物濃度15%(質(zhì)量分數(shù))，纖維素酶用量30 IU/g，接種量7%，基礎培養(yǎng)基，發(fā)酵時間72 h.不同溫度對丁醇發(fā)酵的影響如圖1所示.由圖可知，本試驗中發(fā)酵溫度為37℃時，丁醇產(chǎn)量最高.

圖1 溫度對發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of temperature on fermentation

2.2.2 底物濃度對發(fā)酵的影響

通常采用增加底物的方法，獲得較高的丁醇產(chǎn)量，提高丁醇生產(chǎn)的經(jīng)濟性.但隨著底物的增加，會造成有害抑制物的積累等一系列問題［8］.因此尋找適宜的底物濃度顯得尤為必要.試驗對底物濃度研究條件如下:溫度37℃，纖維素酶用量30 IU/g，接種量7%，基礎培養(yǎng)基，發(fā)酵時間72 h.考察不同底物濃度對發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖2所示.由圖可知，當?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)為15%時，丁醇濃度最高.

圖2 底物濃度對發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on fermentiaon

2.2.3 纖維素酶用量對發(fā)酵的影響

在丁醇發(fā)酵過程中，酶的水解對丁醇的生成有決定性的作用.在溫度37℃，底物濃度15%，接種量7%，基礎培養(yǎng)基，發(fā)酵時間72 h的試驗條件下，不同纖維素酶用量對發(fā)酵的影響如圖3所示.圖中結(jié)果表明，在纖維素酶用量25～40 IU/g的范圍內(nèi)，丁醇濃度隨酶用量的增加而增加.較低的纖維素酶用量，不能有效的將秸稈酶解轉(zhuǎn)化為還原糖，不利于后續(xù)的發(fā)酵;而較高的纖維素酶用量會增加生產(chǎn)成本.因此，選用30 IU/g為較優(yōu)的纖維素酶用量.

圖3 纖維素酶用量對發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of loading of cellulose on fermentation

2.2.4 菌種接種量對發(fā)酵的影響

在發(fā)酵過程中，接種量與菌種的生長速度和丁醇的產(chǎn)量密切相關.因此，在溫度37℃、底物濃度15%、纖維素酶用量30 IU/g、基礎培養(yǎng)基、發(fā)酵時間72 h的試驗條件下，進一步考察接種量對發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖4.接種量為7%時，丁醇產(chǎn)量最高.而接種量過高或過低，都會造成丁醇濃度明顯下降.所以確定7%為最佳接種量.

2.2.5 培養(yǎng)基組成對發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成對菌體的生長代謝和溶劑的生成有重要的影響.因此筆者重點考察了酵母抽提物(A)，KH2PO4(B)，MgSO4·7H2O(C)，(NH4)2SO4(D)，F(xiàn)eSO4·7H2O(E)，尿素(F)和CaCO3(G)7種營養(yǎng)物組成對丁醇濃度的影響.試驗條件為:溫度37℃、底物濃度15%、纖維素酶用量30 IU/g、接種量7%、發(fā)酵時間72 h.試驗采用L32(74)正交試驗進行培養(yǎng)基的優(yōu)化，優(yōu)化試驗及結(jié)果見表2.

由表2的數(shù)據(jù)可以得到，優(yōu)化培養(yǎng)基組成為:KH2PO40.8 g/L，MgSO4· 7H2O 0.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，尿素3 g/L，CaCO38 g/L.

進一步和丁醇濃度最高的28號試驗進行驗證試驗，結(jié)果如表3所示.

由表2和表3的結(jié)果，可得到較優(yōu)的培養(yǎng)基組合為:酵母抽提物 1 g/L，KH2PO40.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L，尿素2 g/L.在此條件下，發(fā)酵的丁醇濃度為9.37 g/L.

圖4 接種量對發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of inoculums on fermentation

2.2.6 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響

發(fā)酵時間直接影響丁醇生產(chǎn)的效率.在溫度37℃，底物濃度15%，纖維素酶用量30 IU/g，接種量7%，優(yōu)化的培養(yǎng)基的條件下，不同發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響結(jié)果見圖5.

圖5 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of fermentation time on fermentation

表2 培養(yǎng)優(yōu)化的正交試驗表Tab.2 Results of orthogonal experiment

試驗結(jié)果表明，當發(fā)酵時間達到48 h時，丁醇濃度已基本趨于平穩(wěn).因此，可以選擇48 h為較優(yōu)的發(fā)酵時間，此時的丁醇含量為9.42 g/L.

表3 兩種培養(yǎng)基對發(fā)酵的影響Tab.3 Effects of two kinds of medium on fermentation

3 結(jié)論

(1)筆者通過對不同糖化發(fā)酵丁醇試驗結(jié)果的比較，得到糖化工藝Ⅴ，即首先加入纖維素酶量的1/3，反應24 h后，再加入1/3纖維素酶，剩下的纖維素酶再隔12 h加入，共糖化48 h是一條較佳的工藝路線.

(2)在糖化工藝Ⅴ的基礎上，通過對丁醇發(fā)酵工藝中8個影響因素的考察研究，得到了在溫度37℃，底物濃度15%，纖維素酶用量30 IU/g，接種量7%，優(yōu)化的培養(yǎng)基組成:酵母抽提物1 g/L、KH2PO40.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L，尿素2 g/L，發(fā)酵周期為48h的條件下，丁醇濃度達到9.42 g/L.

(3)試驗表明汽爆玉米秸稈糖化發(fā)酵丁醇，取得了較好的發(fā)酵效果，為進一步的放大試驗提供參考.

［1］WU M，WANG M，LIU J，et al.Assessment of potential life-cycle energy and greenhouse gas emission effects from using corn-based butanol as a transportation fuel［J］.Biotechnology Progress，2008，24(6):1204-1214.

［2］QURESHI N，SAHA B C，DIEN B，et al.Production of butanol(a biofuel)from agricultural residues:Part I-Use of barley straw hydrolysate［J］.Biomass and Bioenergy，2010，34(4):559-565.

［3］李冬敏，陳洪章.汽爆秸稈膜循環(huán)酶解耦合丙酮丁醇發(fā)酵［J］.過程工程學報，2007，7(6):1212-1216.

［4］陳守文，馬昕，汪履綏，等.稻草酶法水解液的丙酮丁醇發(fā)酵［J］.工業(yè)微生物，1998，28(4):30-34.

［5］常春.生物質(zhì)制備新型平臺化合物乙酰丙酸的研究［D］.杭州:浙江大學材料與化學工程學院，2006.

［6］中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京寧馨兒生物科技開發(fā)有限公司，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司，等.QB 2583—2003附錄A(規(guī)范性附錄)濾紙酶活力(FPA)的測定方法［S］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2003.

［7］劉廣慧，朱文眾，胡鐵功.毛細管氣相色譜法分析丙酮和丁醇發(fā)酵產(chǎn)物［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(11):115-117.

［8］EZEJI T，QURESHI N，BLASCHEK H P.Butanol production from agricultural residues:Impact of degradation products on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation［J］.Biotechnology and Bioengineering，2007，97(6):1460-1469.