薛 闖，杜廣慶

(大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116023)

1 丙酮丁醇梭菌發(fā)酵

丙酮丁醇梭菌是嚴(yán)格厭氧的革蘭陽性菌，可以利用多種五碳糖和六碳糖作為碳源生產(chǎn)有機(jī)溶劑，包括丙酮、丁醇和乙醇，是目前研究最為廣泛的用于丁醇生產(chǎn)的工業(yè)微生物[1]。丁醇是一種重要的化工原料，也是極具潛力的可以替代石油的新型生物燃料[2]。生物丁醇的生產(chǎn)原料和生產(chǎn)工藝與乙醇相近，但是與乙醇相比，丁醇具有更明顯的優(yōu)勢。例如，丁醇具有與汽油相近的高能量密度，蒸汽壓低，腐蝕性小，與汽油混合時(shí)對水的寬容度大，并且能夠與汽油以更高的混合比混合，還可直接用于未經(jīng)改造的汽車發(fā)動(dòng)機(jī)等，這些優(yōu)勢在能源利用上都具有重大意義[3]。近年來，由于石油價(jià)格波動(dòng)和人們對環(huán)境污染問題的重視，以石油為原料生產(chǎn)丁醇的成本日趨增加，弊端也愈加凸顯，使得通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法重新受到關(guān)注[4]。微生物法生產(chǎn)丁醇主要是通過丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發(fā)酵法生產(chǎn)，發(fā)酵菌株主要包括丙酮丁醇梭菌(Clostrdiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)[5-8]。目前，ABE發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的主要問題是丁醇對梭菌細(xì)胞具有毒性抑制作用，使得發(fā)酵過程的產(chǎn)物濃度很低，進(jìn)而導(dǎo)致后期的分離成本偏高，因此需要對現(xiàn)有的菌株進(jìn)行改造來滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求[9]。丙酮丁醇梭菌ATCC 824作為丁醇生產(chǎn)的模式菌株，基因組已經(jīng)于2001年測序完成，其基因組由3 940 kb組成，并含有一個(gè)192 kb的大質(zhì)粒pSOL[10]。隨著基因組學(xué)和基因編輯技術(shù)的發(fā)展，丙酮丁醇梭菌基本的生理和代謝過程已經(jīng)被揭示，通過基因編輯和代謝工程來提高丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵性能(丁醇濃度，得率和生產(chǎn)強(qiáng)度)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本文對當(dāng)前可用于丙酮丁醇梭菌分子改造的基因編輯工具進(jìn)行了總結(jié)，并概述了利用基因編輯提高丙酮丁醇梭菌發(fā)酵性能的研究進(jìn)展。

2 丙酮丁醇梭菌基因編輯工具

丙酮丁醇梭菌作為重要化學(xué)品和重要生物燃料丁醇的主要生產(chǎn)菌，受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。為實(shí)現(xiàn)生物丁醇產(chǎn)業(yè)化，對丙酮丁醇梭菌進(jìn)行菌株改造是一項(xiàng)重要工作。近年來，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因編輯工具應(yīng)用于丙酮丁醇梭菌的分子改造過程。

1996年，Green等[11-13]利用自殺質(zhì)粒同源重組的方法，成功敲除了梭菌中的aad、pta、buk和solR基因。但是，這種方法的轉(zhuǎn)化率和重組效率很低，因此沒有應(yīng)用到后續(xù)的研究中。1999年，Desai 和Papoutsakis利用反義RNA技術(shù)弱化丙酮丁醇梭菌中buk和ptb基因的表達(dá)，使得buk編碼的丁酸激酶和ptb編碼的磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶活性分別下降了85%和70%[14]。2002年，基于復(fù)制型同源重組實(shí)現(xiàn)基因敲除的方法得到發(fā)展，由于復(fù)制型質(zhì)粒在細(xì)胞中可以復(fù)制，增加了同源重組的概率，從而提高了轉(zhuǎn)化成功率，該方法成功用于spo0A基因的敲除[15]。2007年，基于II型內(nèi)含子的基因失活技術(shù)迅速發(fā)展，該方法的基本原理是位于乳酸菌ltrB基因的內(nèi)含子可在特定宿主中表達(dá)，然后通過自剪切脫離mRNA前體，與輔助蛋白LtrA結(jié)合后可識別并插入DNA的靶標(biāo)序列，然后反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)鏈，進(jìn)而以雙鏈DNA形式插入靶向位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)基因的插入型失活[16]。Minton教授團(tuán)隊(duì)和姜衛(wèi)紅研究員團(tuán)隊(duì)分別構(gòu)建了適用于梭菌的內(nèi)含子插入型基因失活質(zhì)粒pMTL007和pSY6，在丙酮丁醇梭菌的分子改造中得到廣泛的應(yīng)用[17-18]。II型內(nèi)含子基因失活技術(shù)雖然存在一定的局限性(需要靶標(biāo)DNA插入位點(diǎn)具有特定的結(jié)構(gòu)，并且內(nèi)含子可能插入非靶點(diǎn)基因，只適用于基因的插入失活，不能用于缺失型失活)，但是由于該方法操作簡單，轉(zhuǎn)化率高，內(nèi)含子片段插入目的基因的成功率高，使其仍然是丙酮丁醇梭菌中應(yīng)用最為廣泛的基因編輯工具?；贑RISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的一系列基因編輯手段，由sgRNA引導(dǎo)，并通過Cas9、Cas9n及dCas9蛋白對基因組進(jìn)行編輯或干預(yù)轉(zhuǎn)錄，廣泛應(yīng)用于生物工程和生物醫(yī)學(xué)方面[19-20]。2016年，Li等[21]成功地利用CRISPR-Cas9技術(shù)將pyrE、adc和agrA基因中的20 bp片段分別更換為EcoRV、EcoRV和PstI限制性內(nèi)切酶識別序列，實(shí)現(xiàn)基因功能的缺失。Wasels等[22]將編碼Cas9蛋白的序列和gRNA序列分別連接到兩個(gè)不同的載體上，其中Cas9蛋白編碼序列源自于釀膿鏈球菌并經(jīng)過密碼子優(yōu)化，使用脫水四環(huán)素誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了在基因組上的單堿基替換、基因敲除和大片段的插入。目前為止，并沒有其他研究報(bào)道CRISPR-Cas9在丙酮丁醇梭菌的應(yīng)用，主要原因是相對于II型內(nèi)含子基因敲除技術(shù)，CRISPR-Cas9更多地應(yīng)用于真核生物中，在丙酮丁醇梭菌中的轉(zhuǎn)化率很低。

圖1 丙酮丁醇梭菌基因編輯工具的發(fā)展Fig.1 Development of genome editing tools for Clostridium acetobutylicum

3 丙酮丁醇梭菌的代謝工程改造

3.1 碳代謝途徑

在ABE發(fā)酵中，丙酮丁醇梭菌最常用的碳源為葡萄糖，可以將葡萄糖通過糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸，然后丙酮酸通過中心碳代謝途徑轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸和ABE溶劑。目前，對丙酮丁醇梭菌糖酵解途徑的基因研究較少，Ventura等[23]通過在丙酮丁醇梭菌ATCC 824中同時(shí)過表達(dá)糖酵解途徑的6-磷酸果糖激酶基因pfkA和丙酮酸激酶基因pykA，提高了細(xì)胞內(nèi)ATP和NADH的濃度和細(xì)胞對丁醇的脅迫耐性，從而使丁醇的產(chǎn)量提高了29.4%，在后續(xù)批次補(bǔ)料發(fā)酵過程中丁醇濃度可達(dá)到19.1 g/L。

木質(zhì)纖維素是自然界中最豐富的生物質(zhì)資源，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其水解產(chǎn)物主要有六碳葡萄糖和五碳木糖及阿拉伯糖[24]。在微生物發(fā)酵過程中能否利用纖維素水解后的混合糖是衡量發(fā)酵性能的一個(gè)重要指標(biāo)，丙酮丁醇梭菌在發(fā)酵過程中雖然可以利用五碳糖中的木糖和阿拉伯糖，但是存在嚴(yán)重的碳分解代謝物阻遏作用(CCR)，即在混合糖發(fā)酵過程中優(yōu)先利用葡萄糖，并抑制其他碳源代謝相關(guān)的基因表達(dá)[25]。Gu等[26]在丙酮丁醇梭菌中過表達(dá)大腸埃希菌中的轉(zhuǎn)醛縮酶基因talA，改造菌株824-TAL在以木糖或以葡萄糖、木糖的混合糖為碳源的發(fā)酵中，木糖利用率和產(chǎn)溶劑能力均顯著提高。Ren等[27]發(fā)現(xiàn)分解代謝物控制蛋白CcpA與丙酮丁醇梭菌中的CCR效應(yīng)相關(guān)，失活CcpA的突變菌株824ccpA可以有效解除CCR效應(yīng)，同時(shí)利用混合糖中的葡萄糖和木糖，發(fā)酵終點(diǎn)丁醇濃度可以達(dá)到12.1 g/L。在后續(xù)研究中，Wu等[28]發(fā)現(xiàn)CcpA蛋白中第302位的纈氨酸是其行使蛋白功能的關(guān)鍵氨基酸，將該氨基酸替換為精氨酸后CCR效應(yīng)減弱，木糖利用率提高，同時(shí)，組成sol操縱子的3個(gè)基因ctfA、ctfB和adhE1表達(dá)均上調(diào)。Bruder等[29]進(jìn)一步闡述了CcpA的作用機(jī)制，CcpA蛋白復(fù)合體可結(jié)合到木糖代謝基因上游的CRE序列，抑制其表達(dá)，通過表達(dá)不含有CRE序列的木糖代謝基因可以將木糖的利用率提高7.5倍。Xiao等[30]發(fā)現(xiàn)參與磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)的GlcG也與CCR效應(yīng)相關(guān)，失活GlcG后的菌株在有葡萄糖存在的發(fā)酵條件下，可以同時(shí)利用木糖和阿拉伯糖，通過在GlcG失活菌株中過表達(dá)木糖代謝途徑的限速酶基因xylA、xylB和xylT，突變菌株對木糖和阿拉伯糖的利用率進(jìn)一步提高。Jin等[31]在丙酮丁醇梭菌ATCC 824中過表達(dá)磷酸戊糖途徑中的4個(gè)關(guān)鍵酶基因，包括轉(zhuǎn)酮酶基因tal、轉(zhuǎn)醛酶基因tkl、核糖-5-磷酸異構(gòu)酶基因rpe和核酮糖-5-磷酸差向異構(gòu)酶基因rpi，提高了菌株對木糖的利用率，溶劑產(chǎn)量相對于野生菌株提高了42%。這些研究表明，丙酮丁醇梭菌經(jīng)過改造，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)利用木質(zhì)纖維素中的六碳糖和五碳糖，這是促進(jìn)ABE發(fā)酵實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的一個(gè)重要方面。

3.2 中心代謝途徑

ABE發(fā)酵過程主要包括兩個(gè)階段：產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期。產(chǎn)酸期主要生產(chǎn)乙酸和丁酸。在產(chǎn)溶劑期，產(chǎn)酸期合成的乙酸和丁酸被重吸收用于合成丙酮、乙醇和丁醇[32]。直接對產(chǎn)酸和產(chǎn)溶劑途徑的基因進(jìn)行改造是調(diào)控溶劑合成最簡單有效的方式。由ctfA、ctfB和adhE1基因組成的sol操縱子，直接負(fù)責(zé)丙酮丁醇梭菌中丁醇的合成，敲除其中任何一個(gè)基因，均造成丁醇產(chǎn)量顯著降低，乙酸和丁酸產(chǎn)量提高[33-35]。Mermelstein等[36]過表達(dá)由adc、ctfA和ctfB組成的ace操縱子，丙酮、丁醇和乙醇的產(chǎn)量與野生菌株相比分別提高了95%、37%和90%。Sillers等使用ptb強(qiáng)啟動(dòng)子過表達(dá)adhE1基因，下調(diào)CoAT表達(dá)，在提高丁醇和乙醇產(chǎn)量的同時(shí)，降低了副產(chǎn)物丙酮的產(chǎn)量，最終總?cè)軇舛冗_(dá)到30 g/L[37]。與丁醇合成直接相關(guān)的編碼醇醛脫氫酶的其他基因還包括adhE2、bdhA、bdhB和cap0059。阻斷adhE2、bdhA和bdhB基因表達(dá)對丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵產(chǎn)物沒有顯著影響，而阻斷cap0059基因表達(dá)，乙酸和丁酸產(chǎn)量降低，丁醇產(chǎn)量提高，其機(jī)理尚未明確[33]。由于有機(jī)酸積累會抑制菌株生長和ABE合成，一些研究通過阻斷有機(jī)酸合成途徑來調(diào)控溶劑代謝。Cooksley等[33]阻斷ack基因表達(dá)，乙酸產(chǎn)量降低，丁醇產(chǎn)量提高了23%，濃度達(dá)到8.6 g/L，而阻斷丁酸合成途徑基因ptb的表達(dá)，只有微量的丙酮和丁醇產(chǎn)量合成，同時(shí)乙醇產(chǎn)量大幅度提高。Jang等[34]阻斷有機(jī)酸代謝途徑基因pta、ptb和buk的表達(dá)，丁醇產(chǎn)量分別提高了46%、18%和22%，濃度分別達(dá)到了17.2、13.9和15.2 g/L。這些研究均表明阻斷有機(jī)酸的合成有利于丙酮丁醇梭菌的產(chǎn)溶劑代謝過程[38]。

丙酮是ABE發(fā)酵生產(chǎn)丁醇過程中最主要的副產(chǎn)物，消除副產(chǎn)物丙酮有利于提高丁醇的得率。丙酮合成途徑對碳源利用和有機(jī)酸重吸收有重要作用，直接阻斷adc基因的表達(dá)，有機(jī)酸重吸收過程被抑制，造成有機(jī)酸積累，丁醇產(chǎn)量降低[39]。Jiang等[40]在阻斷adc基因表達(dá)后，通過添加CaCO3和甲基紫精，在丙酮產(chǎn)量維持在微量的前提下，丁醇產(chǎn)量恢復(fù)到野生菌水平，同時(shí)乙酸濃度降低，最終丁醇在總?cè)軇┲械谋壤岣咧?2%?？梢?，通過對代謝途徑基因進(jìn)行改造，可以有效提高丁醇的比例和產(chǎn)量。然而，雖然通過外源添加CaCO3和甲基紫精可以彌補(bǔ)adc敲除菌丁醇產(chǎn)量降低的缺陷，但是由于添加物的成本問題，不利于丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)。Liu等[41]通過異源表達(dá)枯草芽胞桿菌中的乙偶姻合成途徑基因alsD和2,3-丁二醇合成途徑基因bdhA，在不改變丙酮合成途徑的前提下，將丙酮濃度降低到0.3 g/L，丁醇濃度從11.4 g/L提高到12.1 g/L，同時(shí)2,3-丁二醇濃度可以達(dá)到7.2 g/L，為減少副產(chǎn)物丙酮的合成提供了新思路。

3.3 丁醇脅迫耐性

ABE發(fā)酵終點(diǎn)丁醇濃度難以提高的一個(gè)限制性因素，是丁醇對細(xì)胞的毒害作用使得梭菌對丁醇的耐受濃度不到2%，主要原因包括丁醇進(jìn)入膜后會改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性，降低了細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度，影響了細(xì)胞對葡萄糖的吸收，因此提高發(fā)酵菌株對丁醇的脅迫耐性是提高丁醇產(chǎn)量的一個(gè)重要策略[42]。細(xì)胞膜的流動(dòng)性與飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例相關(guān)，在ABE發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵產(chǎn)物丁醇濃度的增高，或者外源添加丁醇，細(xì)胞膜中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例均會提高[43]。Zhao等[44]在丙酮丁醇梭菌ATCC 824中過表達(dá)環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因cfa，改造菌對丁醇的耐受性大大提高，但是丁醇的產(chǎn)量降低。Bui等在含有丁醇合成途徑的大腸埃希菌中過表達(dá)參與脂肪酸合成的FabD編碼基因，提高了大腸埃希菌對丁醇的耐受性。雖然調(diào)控脂肪酸代謝基因的表達(dá)可以改善菌株對丁醇的耐受性，但是并不能提高丁醇產(chǎn)量[45]。丙酮丁醇梭菌響應(yīng)丁醇脅迫的另一種方式是表達(dá)熱激蛋白，Tomas等[46]通過過表達(dá)熱激蛋白編碼基因groESL，總?cè)軇舛认鄬τ谝吧晏岣吡?0%。Zingaro和Papoutsakis發(fā)現(xiàn)在1%丁醇脅迫條件下，過表達(dá)groESL的改造菌株在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，菌落數(shù)相對于野生型菌株增加了4倍[47]。在大腸埃希菌中異源表達(dá)丙酮丁醇梭菌的groESL基因，同樣可以提高菌株的丁醇脅迫耐性[48]。這些研究說明熱激蛋白GroESL不但與丙酮丁醇梭菌對丁醇的脅迫耐性相關(guān)，還參與調(diào)控丁醇的合成代謝。此外，Mann等[49]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)熱激蛋白編碼基因grpE和htpG，菌株對丁醇的耐受性提高，但是丁醇產(chǎn)量沒有顯著變化，說明提高菌株對丁醇的脅迫耐性和提高丁醇產(chǎn)量并沒有必然的聯(lián)系。

3.4 孢子分化

丙酮丁醇梭菌是嚴(yán)格厭氧的革蘭陽性菌，在發(fā)酵過程中會分化出孢子，由于形成孢子的細(xì)胞不再具有溶劑代謝能力，阻斷孢子形成過程將有利于丁醇的生產(chǎn)[50]。Spo0A是丙酮丁醇梭菌中最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，Spo0A磷酸化后可啟動(dòng)孢子形成，并同時(shí)啟動(dòng)溶劑化形成[51]。Harris等[52]發(fā)現(xiàn)失活Spo0A的突變菌株SKO1基本不產(chǎn)溶劑，也不形成孢子，而過表達(dá)Spo0A編碼基因可加速孢子形成，誘導(dǎo)產(chǎn)溶劑相關(guān)基因提前表達(dá)，并提高脅迫耐性相關(guān)基因的表達(dá)，但是丁醇產(chǎn)量并沒有提高。后續(xù)研究集中于控制孢子形成的sigma因子和其他一些調(diào)控因子，以達(dá)到阻斷孢子分化且不影響丁醇合成的目的。Jones等[53]通過失活σF將孢子周期阻滯在細(xì)胞不對稱分裂之前，并將丁醇產(chǎn)量維持在野生型菌株水平。Tracy等[54]構(gòu)建了σE和σG失活菌株，均有效地阻斷了孢子分化過程，且不影響溶劑合成，但是丁醇產(chǎn)量并沒有提高。Scotcher等[55]通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)spoIIE基因的表達(dá)，延遲了孢子形成，并使丙酮、丁醇和乙醇的濃度相對于對照菌株分別提高了43%、110%和225%，說明可以通過抑制孢子形成進(jìn)程來提高丁醇產(chǎn)量。解除孢子和溶劑合成關(guān)聯(lián)的另一個(gè)方法是以缺失大質(zhì)粒pSOL1的菌株(既不產(chǎn)孢子，也不合成溶劑)為出發(fā)菌，過表達(dá)丁醇合成途徑基因aad，使得缺失pSOL1的菌株可以合成與野生菌株等量的丁醇，而且由于丙酮合成途徑基因adc也在pSOL1上，該菌株可以在保持丁醇產(chǎn)量的前提下，不產(chǎn)生孢子，也不生產(chǎn)副產(chǎn)物丙酮，具有一定的優(yōu)越性[56]。雖然這些研究均成功地抑制了孢子生成，但是丁醇濃度均不超過12 g/L，仍然是ABE發(fā)酵最大的瓶頸。

由于通過改造受Spo0A調(diào)控的Sigma因子雖然可以阻斷孢子合成，但是并不能提高菌株的產(chǎn)溶劑能力，一些研究便開始集中于對Spo0A上游基因進(jìn)行調(diào)控。由于Spo0A磷酸化后才能調(diào)控下游基因表達(dá)，Steiner等[57]研究了Spo0A的磷酸化途徑，發(fā)現(xiàn)組氨酸激酶Cac3319、Cac0323和Cac0903參與Spo0A磷酸化，Cac0437參與Spo0A的去磷酸化，通過失活Cac3319、Cac0323和Cac0903，孢子數(shù)量分別減少至野生菌的1%、4%和5%，而失活Cac0437，孢子數(shù)量增加了30倍，說明可以通過組氨酸激酶實(shí)現(xiàn)Spo0A磷酸化水平的調(diào)控，進(jìn)一步調(diào)控孢子周期，但是該研究并未報(bào)道組氨酸激酶與丁醇合成的關(guān)系。然而，由于Spo0A直接參與溶劑合成的調(diào)控，Spo0A磷酸化水平的改變也被推測有可能調(diào)控丁醇合成。Xu等[58]通過比對經(jīng)過馴化的高產(chǎn)丁醇菌株JB 200(可合成丁醇～20 g/L)和出發(fā)菌株ATCC 55025的基因組發(fā)現(xiàn)，JB 200的組氨酸激酶Cac3319丟失一個(gè)氨基酸造成移碼突變，并經(jīng)研究表明通過II型內(nèi)含子基因敲除技術(shù)失活Cac3319后的突變菌株HKKO在ABE發(fā)酵中的丁醇濃度可以達(dá)到18.2 g/L，與JB 200基本接近，且對丁醇的脅迫耐性提高。Herman等[59]發(fā)現(xiàn)敲除多酮類物質(zhì)合成基因pks，可以抑制淀粉粒合成和孢子形成，同時(shí)提高丁醇產(chǎn)量。雖然該研究并未揭示其內(nèi)在機(jī)理，但是敲除pks和cac3319得到了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明兩者可能存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)?？傊ㄟ^改造Spo0A上游基因來實(shí)現(xiàn)對Spo0A磷酸化水平的精密調(diào)控，為同時(shí)提高ABE各項(xiàng)發(fā)酵性能提供了新的思路。

4 代謝工程改造存在問題

丙酮丁醇梭菌作為丁醇的主要生產(chǎn)菌株，丁醇產(chǎn)量相對較高，但是由于需要在厭氧條件下培養(yǎng)，其分子操作過程會更加繁瑣。Dong等[60]通過失活響應(yīng)氧脅迫的抗性基因cac2634，提高了梭菌細(xì)胞的耐氧能力，并可實(shí)現(xiàn)在空氣中進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，但是其轉(zhuǎn)化率要低于厭氧操作條件，說明空氣中的氧氣對菌株的存活仍然有負(fù)面作用。丙酮丁醇梭菌中存在Cac824I二型限制修飾系統(tǒng)，可以降解外源DNA入侵，保護(hù)自身DNA不被破壞，增加了丙酮丁醇梭菌基因改造的難度[61]。為了解決這一問題，Mermelstein等[62]利用含有枯草芽胞桿菌噬菌體Ф3TI甲基化酶的pAN1質(zhì)粒對需要轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒進(jìn)行甲基化修飾，可以防止外源質(zhì)粒被降解，實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的成功轉(zhuǎn)化，但是甲基化修飾延長了分子操作時(shí)間。Dong等[63]嘗試在丙酮丁醇梭菌中阻斷二型限制性內(nèi)切酶基因cac1502的表達(dá)，成功解除了限制修飾系統(tǒng)的限制，使外源DNA無需甲基化即可轉(zhuǎn)入梭菌中，這種方法也應(yīng)用到后續(xù)的一些研究中。

迄今為止，用于梭菌的基因編輯技術(shù)主要有五種，其中基因敲除技術(shù)如自殺質(zhì)粒基因敲除，反義RNA干擾和復(fù)制型質(zhì)粒同源重組操作過程繁瑣且轉(zhuǎn)化率不高，而應(yīng)用最為廣泛的II型內(nèi)含子基因敲除技術(shù)只能通過插入內(nèi)含子片段阻斷基因表達(dá)，并不能保證基因功能完全喪失。基于CRISPR-cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)雖然可以實(shí)現(xiàn)基因的整段刪除、替換和抑制表達(dá)等，但是在丙酮丁醇梭菌中的應(yīng)用案例較少，基因操作不成熟，轉(zhuǎn)化率不高?？梢?，對丙酮丁醇梭菌的基因改造仍需要更簡單高效的基因編輯工具。

近年來，研究學(xué)者為了提高丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵性能，構(gòu)建了很多性能優(yōu)良的發(fā)酵菌株，旨在提高發(fā)酵菌株的丁醇產(chǎn)量、丁醇在總?cè)軇┲械谋壤约岸〈嫉拿{迫耐性，縮短發(fā)酵時(shí)間，阻斷孢子周期，使發(fā)酵菌株可在長時(shí)間連續(xù)培養(yǎng)模式中持續(xù)合成丁醇。但是由于缺乏對丙酮丁醇梭菌生理特性及整個(gè)ABE代謝過程的理解，丁醇產(chǎn)量始終不能大幅度提高，或者只能提高菌株的部分性能，例如阻斷孢子形成的菌株，丁醇產(chǎn)量均不超過～12 g/L，丁醇的生產(chǎn)強(qiáng)度不超過0.12 g/L/h，而對代謝途徑基因進(jìn)行改造，丁醇產(chǎn)量可以提高至～18 g/L，但是由于孢子分化的影響，不能連續(xù)培養(yǎng)，這些均限制了實(shí)現(xiàn)丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)。而且，通過對丙酮丁醇梭菌進(jìn)行各種定向的分子改造，所得突變菌株所能合成的最高丁醇濃度，均未能達(dá)到化學(xué)誘變菌株拜氏梭菌BA 101和馴化菌株丙酮丁醇梭菌JB 200發(fā)酵生產(chǎn)的丁醇濃度(～20 g/L)[64-65]。

5 展 望

迄今為止，通過ABE發(fā)酵生產(chǎn)生物丁醇已經(jīng)有100多年的歷史，由于原料價(jià)格高，丁醇轉(zhuǎn)化率低以及丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度低，制約了丁醇發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。伴隨分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，丙酮丁醇梭菌的分子遺傳改造取得了很大進(jìn)步，并且隨著代謝網(wǎng)絡(luò)模型、系統(tǒng)代謝工程、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，丙酮丁醇梭菌的生理特性和代謝機(jī)理也被進(jìn)一步揭示。今后對丙酮丁醇梭菌研究的重點(diǎn)將集中于以下幾個(gè)方面：①丙酮丁醇梭菌中有35個(gè)組氨酸激酶，目前只有參與Spo0A磷酸化和去磷酸化的5個(gè)組氨酸激酶功能被揭示，而其他組氨酸激酶的功能尚不明確，仍需研究丙酮丁醇梭菌中組氨酸激酶參與的雙組分系統(tǒng)功能，以及組氨酸激酶如何參與細(xì)菌中的細(xì)胞分裂、鞭毛運(yùn)動(dòng)、群體效應(yīng)、孢子分化和產(chǎn)物代謝等多個(gè)過程，對這些組氨酸激酶進(jìn)行系統(tǒng)研究將對了解丙酮丁醇梭菌的生理特性和代謝調(diào)控具有重要指導(dǎo)意義；②深入研究Spo0A對孢子分化和溶劑形成的作用機(jī)制，進(jìn)一步研究如何通過調(diào)控Spo0A的轉(zhuǎn)錄水平和磷酸化水平來有選擇性的抑制孢子分化，促進(jìn)丁醇合成；③優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高梭菌細(xì)胞活性、培養(yǎng)密度和對丁醇的耐受性，使得梭菌細(xì)胞可以在長時(shí)間的連續(xù)發(fā)酵中不自溶、不退化；④直接利用纖維素原料生產(chǎn)丁醇，丙酮丁醇梭菌中存在降解纖維素的纖維小體，但是活性很低，不能直接利用纖維素原料，通過合成生物學(xué)的方法提高丙酮丁醇梭菌降解纖維素的活性，將極大地降低原料成本，提高ABE發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的經(jīng)濟(jì)性。

總之，通過系統(tǒng)調(diào)控丙酮丁醇梭菌的生理和代謝，使其可以持續(xù)地將碳源轉(zhuǎn)化為丁醇，從而使微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物丁醇實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。丁醇作為理想的石油替代品或者添加劑，隨著ABE發(fā)酵上游基因改造和下游過程工程技術(shù)的完善，將在生物燃料市場中發(fā)揮重要作用。