王 琳，李志英，常小娟，劉 欣，王衛(wèi)衛(wèi)

(1.西安醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021；2.西部生物資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，陜西 西安 710069)

定殖于植物根際的根際促生菌的促生機(jī)制有直接和間接兩種方式[1]。直接促進(jìn)作用包括固氮作用，產(chǎn)生植物生長激素，分泌鐵載體，合成ACC脫氨酶、溶磷等[2-4]；間接促進(jìn)作用包括產(chǎn)生抗生素，與病原菌競爭根際有限的營養(yǎng)與空間，抑制根際病原菌的生長，增強(qiáng)植物抗病能力[1]。鑒于植物根際促生菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力，優(yōu)勢植物根際促生菌的分離鑒定已成為非常有價值的一項工作。豆科作物的輪作、間作效益多被歸功于豆科作物根部根瘤菌的固氮作用，而已有研究表明氮肥不能完全取代豆科作物的輪作效果，大約75%的增產(chǎn)效益還不能用現(xiàn)有理論解釋[5]。因此，Dong等[6]的研究表明根瘤菌在固氮過程中釋放的氫氣促進(jìn)根際氫氧化細(xì)菌的生長，氫氧化細(xì)菌通過某些方式促進(jìn)植物生長。但是，豆科植物根際的氫氧化細(xì)菌不易分離，導(dǎo)致其研究工作不充分，把氫氧化細(xì)菌作為一類植物根際促生菌，并進(jìn)一步分析其促生特征的研究鮮有報道。本研究利用氣體循環(huán)培養(yǎng)體系從豆科植物沙打旺根際土壤中分離氫氧化細(xì)菌，并分析其分泌吲哚乙酸(IAA)、分泌鐵載體、合成ACC脫氨酶等促生特征，最后根據(jù)16S rDNA序列分析和相關(guān)生理生化特征進(jìn)行分類鑒定，發(fā)現(xiàn)有較高研究價值的菌株，拓展人們對氫氧化細(xì)菌分類地位的認(rèn)識，并初步探究氫氧化細(xì)菌的促生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣的采集 從西北大學(xué)果園中選1株生長旺盛的沙打旺連根拔起，把附著在根部根瘤上的土輕輕轉(zhuǎn)移到取樣袋中，迅速保存于4 ℃環(huán)境。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①MSA無機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO42.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 5.0 g，(NH4)2SO45.0 g，MgSO40.2 g，CaCl20.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，H2O 1 000 mL，瓊脂16 g，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min；②KingB-Trp培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，K2HPO41.15 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，甘油15 mL，L-Trp 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；③DF基本培養(yǎng)基：葡萄糖2.0 g，D-葡萄糖酸4.0 mL，檸檬酸2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO44.0 g ，Na2HPO46.0 g，微量元素1.0 mL(FeSO4·7H2O 1.0 mg，H3BO310 mg，MnSO4·H2O 11.19 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，CuSO4·5H2O 78.22 mg，MnO310 mg，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2)。

1.2 方法

1.2.1 氫氧化細(xì)菌的分離篩選 取10 g土樣轉(zhuǎn)移到裝有90 mL無菌水的錐形瓶中，180 r/min、30 min搖勻后，從錐形瓶中吸取0.1 mL上層懸浮液加到0.9 mL無菌水中混勻，并作一系列10倍梯度的稀釋，最終稀釋倍數(shù)為10-12。從每個梯度中取0.1 mL菌液于MSA無機(jī)鹽平板培養(yǎng)基上稀釋涂布，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)。平板在連續(xù)通氫裝置(通過電解水產(chǎn)生氫氣，濃度為4.16×10-4～2.42×10-3mol/L)中30 ℃培養(yǎng)7 d。

1.2.2 細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化特征鑒定 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征鑒定參照《微生物學(xué)實驗》[7]，生理生化特征鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]。

1.2.3 16S rDNA序列測定 接種環(huán)挑取純化的單菌落懸浮于裝有500 μL超純水的離心管中，沸水浴10 min，立即冰浴5 min，然后離心(12 000 r/min、10 min)，上清液即為模板DNA。上清液轉(zhuǎn)移到無菌的1.5 mL離心管中備用。通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)用于細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增。每10 μL PCR體系包括：模板0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，2×Taqmaster Mix 5 μL，dd H2O 3.8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 min，33個循環(huán)；72 ℃終止延伸10 min。擴(kuò)增完成后將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行純化和測序。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將得到的16S rDNA序列錄入NCBI網(wǎng)站，與已知序列比對并分析同源性。用MEGA 5.05軟件將各序列對位排列，適當(dāng)人工校正后以鄰接(Neighbor-joining)法和Kimura 2參數(shù)模型建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 吲哚乙酸(IAA)檢測 將待測菌株接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)，24 h。取1.0 mL菌液以5 000 r/min離心10 min后棄上清，無菌水洗滌2次后稀釋10倍。取上述菌懸液0.1 mL(約10-7cfu/mL)接種到50 mL KingB-Trp培養(yǎng)基，30 ℃，180 r/min搖床避光培養(yǎng)72 h，每株菌3個重復(fù)。IAA含量測定根據(jù)Salkowski法[9]。將培養(yǎng)液10 000 r/min離心10 min后，取上清液1.0 mL加入避光的凍存管中與1.0 mL Salkowski試劑(1.015 g FeCl3·6H2O，150 mL H2SO4，250 mL ddH2O)混勻，室溫下放置20 min。然后在530 nm波長下測定吸光度。IAA濃度計算參照IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線(濃度10～100 μg/mL)。

1.2.6 ACC脫氨酶活性檢測 ①ACC脫氨酶陽性菌株的篩選：篩選依據(jù)是菌株能否在以ACC為惟一氮源的平板上生長。待測菌株分別接種到無氮的DF基本培養(yǎng)基和添加3.0 mmol ACC為惟一氮源的DF基本培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d。不能在無氮源的DF基本培養(yǎng)基上生長，能在添加3.0 mmol ACC為惟一氮源的DF基本培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌則初步鑒定為含有ACC脫氨酶。②ACC脫氨酶活性檢測：茚三酮比色法檢測菌株酶活力。首先分別取10、50、100、200、300、400、500 μg/mL ACC溶液各5 mL分別置于50 mL比色管中，再向其中加入1 mL 0.5%的茚三酮試劑，充分搖勻。90 ℃水浴25 min后冷卻至室溫，用721型分光光度計在570 nm下測得其光密度值。以標(biāo)準(zhǔn)液的光密度值和濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將篩選的菌株接種到含0.5 g/L的ACC檢測培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液10 000 r/min，4 ℃離心30 s取上清液。以同樣的反應(yīng)量與反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，并在570 nm條件下測定其吸光值。

1.2.7 鐵載體檢測 細(xì)菌分泌鐵載體能力的檢測參照CAS(Chrom-Azurol Siderophore)平板法[10]。平板顏色從藍(lán)色變?yōu)榻埸S色，則認(rèn)為有鐵載體產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株SDW-16的獲得

根據(jù)氫氧化細(xì)菌獨特的代謝特點，選取不含碳源的MSA無機(jī)鹽培養(yǎng)基分離篩選氫氧化細(xì)菌，在H2、CO2、O2組成的混合氣體中，只有氫氧化細(xì)菌能以H2為能源，CO2為碳源進(jìn)行化能自養(yǎng)生長。在MSA無機(jī)鹽固體平板上30 ℃培養(yǎng)7 d后，從平板上挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)一步劃線純化，得到11株氫氧化細(xì)菌。以平板培養(yǎng)篩選自養(yǎng)能力強(qiáng)的菌株，得到菌株SDW-16。

2.2 菌株SDW-16的形態(tài)特征和生理生化特征

菌株SDW-16為桿狀，大小為(0.6～0.8 )μm×(2.0～2.5)μm，革蘭染色陰性。在MSA無機(jī)鹽固體平板上30 ℃培養(yǎng)7 d后形成1 mm左右的菌落，菌落為乳白色，圓形，邊緣整齊，表面光滑，其生理生化特征見表1。

2.3 16S rDNA序列分析

菌株SDW-16的16S rDNA片段長度為1 526 bp，GenBank登錄號為KF835389。16S rDNA序列擴(kuò)增結(jié)果見圖1。SDW-16 16S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹得出，SDW-16菌株與熒光假單胞菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上位于相同的發(fā)育分支(圖2)，且同源性為99%，同時結(jié)合生理生化特征，鑒定菌株SDW-16為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。

表1 菌株SDW-16的生理特征Table 1 Physiological characteristics of strain SDW-16

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性

圖1 菌株SDW-16 16S rDNA序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of strain SDW-16 16S rDNA sequenceM：Marker；1：SDW-16

2.4 菌株SDW-16的吲哚乙酸(IAA)含量

有些植物根際促生菌能分泌IAA促進(jìn)植物根的生長發(fā)育，對植物生長產(chǎn)生積極的影響[11]。在KingB-TrP培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，菌株SDW-16產(chǎn)生IAA的量為(21.62±0.30)μg/mL，達(dá)到較高水平。

2.5 菌株SDW-16的ACC脫氨酶活性

細(xì)菌不能在無氮源的DF基本培養(yǎng)基上生長，能在添加3.0 mmol ACC為惟一氮源的DF基本培養(yǎng)基上生長則認(rèn)為具有ACC脫氨酶活性，對符合此特征菌株SDW-16的ACC脫氨酶活性高達(dá)(8 372.17±805.43)nmol/(mg·h)。

2.6 菌株SDW-16的鐵載體

在鐵缺乏的條件下對菌株SDW-16進(jìn)行鐵載體檢測，結(jié)果顯示接種有SDW-16的CAS檢測平板在3 d后從藍(lán)色變?yōu)榻埸S色(圖3)，證明菌株SDW-16具有產(chǎn)生鐵載體的能力。

圖2 以菌株SDW-16 16S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on strain SDW-16 16S rDNA sequence

圖3 菌株產(chǎn)鐵載體Fig.3 Iron carrier map of strain

3 討 論

植物根際促生菌不但可以促進(jìn)植物生長，而且可以減少因使用傳統(tǒng)化學(xué)肥料造成的環(huán)境污染，在世界上一些地區(qū)的實際應(yīng)用中取得了良好的效果，鑒于植物根際促生菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的巨大應(yīng)用潛力，其研究在國際上越來越受重視。目前已知的植物根際促生菌種類主要包括芽胞桿菌屬(Bacillus)、固氮菌屬(Azotobacter)、黃桿菌屬(Flavobacteria)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、歐文氏菌屬(Erwinia)、慢生型根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等[12-14]。

Mclean等[15]和Dong等[16]的研究證實氫氧化細(xì)菌也屬于一類根際促生菌，而且通過大田試驗和實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用也證實了氫氧化細(xì)菌的促生能力。氫氧化細(xì)菌獨特的代謝特點使其成為根際促生菌家族中的獨特種群，豆科植物多為重要的經(jīng)濟(jì)作物，其根瘤附近的富氫環(huán)境也非常適合氫氧化細(xì)菌生長，因此我們從沙打旺根際土壤中分離有潛在促生價值的菌株。鑒于氫氧化細(xì)菌獨特的代謝特點，本研究利用不含碳源的MSA無機(jī)鹽培養(yǎng)基對其進(jìn)行分離培養(yǎng)，連續(xù)通氫裝置可以模擬豆科植物根瘤附近的富氫環(huán)境。

植物在遭遇干旱、水災(zāi)和鹽堿等逆境條件下會產(chǎn)生過量乙烯而不利于自身的生長發(fā)育。ACC脫氨酶能裂解乙烯的前體ACC為氨和a-丁酮酸，降低乙烯水平減輕乙烯對植物生長的不利影響，所以產(chǎn)生ACC脫氨酶是重要的促生機(jī)制之一。

菌株SDW-16的ACC脫氨酶活性高達(dá)(8 372.17±805.43)nmol/(mg·h)，遠(yuǎn)高于AS(1 116 nmol/(mg·h))和CS(1 002 nmol/(mg·h))兩株菌[17]；高于68%的ACC脫氨酶陽性株菌，與該文中菌株YsS3(8 580 nmol/(mg·h))和YsS2(9 880 nmol/(mg·h))的酶活性相當(dāng)[18]。研究表明這些菌株都能產(chǎn)生明顯的促生效果，關(guān)于ACC脫氨酶活性，SDW-16高于或達(dá)到其他植物根際促生菌，可見菌株SDW-16也具有較大促生潛力。

植物激素吲哚乙酸(IAA)是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的主要激素，在促進(jìn)植物生長發(fā)育中起重要作用。本研究中菌株SDW-16產(chǎn)生IAA的量為(21.62±0.30)μg/mL，高于63.6%的IAA陽性菌株[19]。對菌株SDW-16培養(yǎng)72 h后測定IAA含量，因為此時細(xì)菌處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)液中IAA含量水平最高。IAA見光易分解的特性要求在實驗過程中要采取避光措施，減少對試驗結(jié)果的影響。

鐵載體是細(xì)菌在鐵缺乏環(huán)境中分泌的一種對Fe3+有很強(qiáng)特異螯合作用的低分子量化合物，在鐵脅迫環(huán)境中植物根際細(xì)菌可以分泌鐵載體螯合周圍的Fe3+促進(jìn)自身生長，同時還能抑制有害病原菌吸收Fe3+，從而增強(qiáng)植物的抗病性。CAS 檢測平板由藍(lán)色變?yōu)榻埸S色，表明菌株SDW-16具有分泌鐵載體的能力。

基于16S rDNA序列及相關(guān)生理生化特征，菌株SDW-16 被鑒定為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。熒光假單胞菌是一種重要的植物根際促生菌，相比其他根際促生菌具有分布廣、數(shù)量多、營養(yǎng)需要簡單、繁殖快、競爭定殖力強(qiáng)等特點。其中一些菌株還可用于植物病害防治，如水稻鞘腐病(Sarocladiumoryzae)、小麥根腐病(Pythiumspp.)、棉花碎倒病(Pythiumultimum)、棉花立枯病(Rhizoctonaisolani)、煙草黑脛病(Phtophthoraparasiticavar.nicotianae)等[20]。促生特征分析表明，SDW-16具有多項植物根際促生菌具備的重要促生特征，且分泌IAA和ACC脫氨酶的能力均達(dá)到較高水平，尤其是其ACC脫氨酶活力高達(dá)(8 372.17±805.43)nmol/(mg·h)，研究表明[21-22]，菌株的促生能力與其ACC脫氨酶活力呈顯著正相關(guān)性。

SDW-16是1株具有較大促生潛力和較高研究價值的菌株，后續(xù)要開展其實際促生效果(盆栽或田間試驗)的研究，爭取將其應(yīng)用于實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。菌株SDW-16的發(fā)現(xiàn)不但豐富了人們對氫氧化細(xì)菌分類地位的認(rèn)識，而且增加了優(yōu)勢根際促生菌的菌種資源。