趙永鑫 ，王曉紅，王 英，郭宇航，范學(xué)財，王 勇，包名家，張曉麗*

(1．佳木斯大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 檢驗科，黑龍江 佳木斯 154007；2．佳木斯大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗科，黑龍江 佳木斯 154003；3.佳木斯市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江 佳木斯 154000)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是醫(yī)院主要的條件致病菌[1]。由于碳青霉烯類藥物的廣泛應(yīng)用，近年來，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(Carbapenem ResistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)在世界范圍蔓延的報道屢見不鮮[2]。細(xì)菌生物膜存在于各種物體表面，幾乎所有的細(xì)菌都具有形成生物膜的能力。鮑曼不動桿菌在48 h內(nèi)就能夠形成成熟的生物膜，其相關(guān)感染最常見的就是醫(yī)療設(shè)備感染[3]，特別是醫(yī)院入侵設(shè)備，如機(jī)械通氣、氣管插管等。生物膜的形成在一定程度上促進(jìn)了菌株在醫(yī)院環(huán)境中的定殖、播散、流行。本研究通過MLST及ERIC-PCR分析佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院CRAB的分子分型及同源性，通過對比分析CRAB與碳青霉烯類敏感鮑曼不動桿菌(Carbapenem-sensitiveAcinetobacterbaumannii，CSAB)生物膜形成能力，討論生物膜形成與碳青霉烯類耐藥性獲得的相關(guān)性，為控制其交叉感染和傳播提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2013至2014年佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離CRAB 35株，剔除重復(fù)菌株，采用VITEK II全自動細(xì)菌鑒定儀對菌株鑒定并進(jìn)行體外敏感實(shí)驗，E-test法測定亞胺培南和美羅培南。篩選菌株于-80 ℃保存?zhèn)溆?，根?jù)簡單隨機(jī)抽樣原則從CSAB中選取38株作為生物膜形成能力分析的對比菌株。

1.1.2 主要試劑 PCR-MⅨ購自promega corporation USA，結(jié)晶紫購自珠海貝索生物有限公司，E-test試紙條購自鄭州安圖生物股份有限公司，7對管家基因及ERIC引物核苷酸序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 MLST 煮沸法制備DNA模板。PCR 擴(kuò)增7個管家基因https：//pubmlst.org/abaumannii/info/primers_Pasteur.shtml，序列見表1。PCR反應(yīng)條件為 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，100 V 50 min，PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測序。序列分析使用Pasteur MLST 將測序后序列輸入網(wǎng)站(http：//pubmlst.org/abaumannii/)進(jìn)行序列查詢，最終確定ST型。

表1 管家基因引物序列Table 1 Housekeeping gene primer sequences

1.2.2 ERIC 引物ERIC-2 (AAGTAAGTGACTGG-GGTGAGCG)，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，40 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min,30個循環(huán)；65 ℃ 6 min。

1.2.3 結(jié)晶紫染色法生物被膜形成能力定量分析 取單個菌落于4 mL LB肉湯120 r/min 培養(yǎng)18 h；生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?6孔板加入200 μL肉湯，實(shí)驗菌液10 μL，4復(fù)孔，35 ℃培養(yǎng)24 h；PBS緩沖液沖洗3次；加入1∶10稀釋的甲醛200 μL固定15 min；200 μL結(jié)晶紫染色15 min；去離子水沖洗，200 μL無水乙醇輕微震蕩10 min，570 nm處讀取吸光值，重復(fù)3次，取均值為該菌株最終D值。生物被膜形成能力定量判讀標(biāo)準(zhǔn)[4]：測定陰性對照(LB肉湯)吸光值N，平均N+3S定義為Dc，將待測菌株D值與Dc進(jìn)行比較：陰性(-)：D≤Dc；弱陽性(1+)：Dc4Dc。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS2.0統(tǒng)計軟件，Kruskal-Wallis秩和檢驗比較CRAB與CSAB生物被膜形成能力，組間多重比較采用Bonferroni方法進(jìn)行校正。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ICU鮑曼不動桿菌檢出率

2014至2017年佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院ICU檢出耐鮑曼不動桿菌189株，CRAB的檢出率從2014年的92.00%降低至2017年的11.39%(表2)。

表2 2014至2017年ICU患者檢出鮑曼不動桿菌及CRAB檢出率(%)Table 2 Detection of Acinetobacter baumannii (%)and CRAB (%)in ICU patients in 2014-2017

2.2 藥敏實(shí)驗結(jié)果

CRAB除復(fù)方新諾明(17.14%)、妥布霉素(2.86%)、左氧氟沙星(36.36%)、頭孢哌酮/舒巴坦(91.30%)、替加環(huán)素(100%)以外，其余全部耐藥，CSAB對14種抗生素的敏感率均大于80.00%，具體見表3。

2.3 耐藥基因攜帶結(jié)果

CRAB攜帶OXA類酶情況，結(jié)果如表4所示。部分樣本多重PCR電泳結(jié)果見圖1。

2.4 MLST及ERIC結(jié)果

在檢測的35株CRAB中，33株ST 2型，是佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院主要流行克隆型，主要分離于ICU(16/35)和急診(9/35)，分離樣本主要是痰液(80.82%)。ST 671型也被發(fā)現(xiàn)，在將測序結(jié)果拼接比對時，發(fā)現(xiàn)1株新型，將其命名為ST 1199型，見表4。ERIC-PCR 結(jié)果顯示分為A、B、C、D四型，A型9株，B型24株，C型1株，D型1株。部分電泳圖結(jié)果見圖2。

表3 CRAB與CSAB的藥敏分析Table 3 Susceptibility analysis of CRAB and CSAB

圖1 blaOXA-23、blaOXA-51和blaOXA-24多重PCR電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of blaOXA-23，blaOXA-51 and blaOXA-24 by multiple PCR M：1 500 bp Marker；OXA-23(73，142)；OXA-51(22，73，85，86，142)；OXA-24(22)

圖2 部分菌株 ERIC-PCR 圖譜Fig.2 The partial result of genotyping by using ERIC-PCR method M：Marker(bp)；70：A型；111、114、116、118、122、126、131、132：B型；77：C型；125：D型

表4 碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的分子特征及耐藥基因Table 4 Molecular characteristics and drug resistance genes of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

注：ERIC為腸道細(xì)菌基因重復(fù)序列；MLST為多序列位點(diǎn)分型；“+”為存在耐藥基因；“-”為不存在耐藥基因

2.5 生物被膜檢測結(jié)果

對73株臨床分離的CRAB與CSAB進(jìn)行生物膜形成能力的定性分析，檢測結(jié)果見表5，判定標(biāo)準(zhǔn)如前所述。統(tǒng)計分析結(jié)果提示佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院CRAB組總體上生物膜形成能力較CSAB組下降(0.330±0.258、0.534±0.402，Z=2.843，P=0.004)，提示碳青霉烯類耐藥性的獲得可導(dǎo)致生物膜形成能力的下降。

表5 CRAB與CSAB生物膜形成能力定性分布Table 5 Qualitative distribution of CRAB and CSAB biofilm formation capacity

2.6 blaOXA基因攜帶與生物膜形成能力的相關(guān)性

根據(jù)OXA酶攜帶情況，分為3組，1組代表blaOXA-23(-)blaOXA-51(+)，2組代表blaOXA-23(+)blaOXA-51(+)，3組代表blaOXA-24(+)，4組為CSAB對照組，其生物膜形成能力見圖3，圖中的點(diǎn)是各菌株生物膜吸光度的平均值，每組的均值已經(jīng)列出。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示CRAB生物膜形成能力與3種耐藥基因攜帶情況均無明顯相關(guān)性(P=0.369)，具體見表6。

表6 blaOXA基因與生物膜形成能力的相關(guān)性Table 6 Correlation of blaOXA gene with biofilm formation ability

圖3 CRAB與CSAB生物膜形成能力Fig.3 Biofilm formation in the CRAB and CSAB

3 討 論

鮑曼不動桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，除了其固有的抗藥性外，還可以獲得抗藥基因，包括產(chǎn)碳青霉烯酶，外膜孔蛋白缺失，青霉素結(jié)合位點(diǎn)改變，外排泵的高度表達(dá)，生物膜的形成等。碳青霉烯酶是指能夠水解至少一種碳青霉烯類抗生素的一類β-內(nèi)酰胺酶。Ambler分類包括A、B、D類酶。碳青霉烯水解D類β-內(nèi)酰胺酶(CHDLs)，也稱為苯唑西林酶(OXA)，是在鮑曼不動桿菌臨床分離株中發(fā)現(xiàn)廣泛的β-內(nèi)酰胺酶。已鑒定出6個群，包括OXA-51-like、OXA-23-like、OXA-40/24-like、OXA-58-like、OXA-143-like和OXA-48-like[5]。佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的D類酶為blaOXA-23、blaOXA-51、blaOXA-24，其主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)blaOXA-23[6]，這一發(fā)現(xiàn)與俄羅斯和中東地區(qū)的結(jié)果相似[7-8]。有報道稱blaOXA-23的攜帶可以增加CRAB在醫(yī)院暴發(fā)的風(fēng)險因素[9]。

分子流行病學(xué)在監(jiān)測CRAB的流行及暴發(fā)感染方面具有重要的作用。鮑曼不動桿菌臨床分離株MLST的種群結(jié)構(gòu)由I、II和Ⅲ的三個國際克隆譜系組成，CC1(ST 1、ST 7、ST 8、ST 19和ST 20)，CC2(ST 2、ST 45和ST 47)，CC3(ST 3和ST 14)，大多數(shù)暴發(fā)菌屬于CC1和CC2[10]。ST 2型是世界上鮑曼分布最廣的ST型[11]，對于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院ST 2型的暴發(fā)，與我國安徽地區(qū)報道分型一致，意大利也有對于ST 2型院內(nèi)暴發(fā)的報道[12-13]，說明本地區(qū)與世界流行克隆具有同源性。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，ST 2型與OXA類酶(OXA-23或OXA-24)有關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。從2014年起，佳木斯附屬第一醫(yī)院采取合理措施對可能的影響因素進(jìn)行控制，例如：醫(yī)院內(nèi)空氣、地面、機(jī)器設(shè)備進(jìn)行徹底消毒處理；醫(yī)務(wù)人員嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)章制度，取得了初步成效。由此可見，造成ST 2型在醫(yī)院暴發(fā)的最可能影響因素為醫(yī)務(wù)人員的消毒意識不足，其次在ICU中多為免疫力低下的患者，增加了感染概率。

細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌在生長過程中黏附于生物或非生物表面，由細(xì)菌自身分泌的胞外多糖基質(zhì)組成的細(xì)菌群體，是水平基因轉(zhuǎn)移的極好環(huán)境，可導(dǎo)致耐藥基因的獲得[15]?？量虠l件下，在生物膜群落內(nèi)會使耐藥基因水平轉(zhuǎn)移并選擇出形成能力高的菌株。臨床分離的鮑曼不動桿菌幾乎都有形成生物膜的能力，其檢測主要分為定性法和定量法，本研究采用標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板法，通過測量結(jié)晶紫的吸光度，定量檢測生物膜的含量。抗生素耐藥與生物膜形成是CRAB在醫(yī)院流行的主要原因[16]。生物膜使鮑曼不動桿菌適應(yīng)惡劣的環(huán)境，抑制抗生素對細(xì)菌的殺滅作用，使CRAB引起的感染在臨床中很難治愈。有研究發(fā)現(xiàn)[17]，菌毛合成系統(tǒng)、BfmRS雙組分調(diào)控系統(tǒng)、細(xì)菌QS、生物膜相關(guān)蛋白(Bap)及外膜蛋白都對鮑曼不動桿菌生物膜的形成有影響。本研究中，CRAB生物膜形成力相對弱于CSAB組，與Babapour等[18]的報道一致，且與blaOXA攜帶情況無明顯相關(guān)性。由于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院CRAB菌株較少，且主要克隆流行ST 2型，所以無法全面分析各ST分型在生物膜形成能力上的區(qū)別。另外，生物膜作為重要的毒力因素，沒有對鮑曼不動桿菌的致病力和毒力進(jìn)行分析，需要進(jìn)一步研究。

總之，這是佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院首次對于CRAB流行病學(xué)情況進(jìn)行分析與研究，生物膜的形成與院感密切相關(guān)。針對醫(yī)院ST 2型CRAB的暴發(fā)，應(yīng)該在合理應(yīng)用治療藥物同時，加強(qiáng)嚴(yán)格消毒的意識，特別是在進(jìn)行侵入性操作時，應(yīng)切斷交叉感染途徑，降低院內(nèi)感染暴發(fā)的風(fēng)險。