翟愛霞，顏冬梅，王海萍，卜 桐，崔樂樂，考文萍，張鳳民*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室 伍連徳研究所 黑龍江省感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江省普通高校病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江省普通高校感染與免疫科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 黑龍江 哈爾濱 150081；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

I型干擾素(interferon,IFN)是一種在抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，包括IFN-α和IFN-β[1-2]。許多物質(zhì)可以誘導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生，如各種病毒、真菌、寄生蟲、雙鏈RNA、細(xì)菌脂多糖等，其中以病毒和雙鏈RNA的誘導(dǎo)最為有效[3-5]。RNA病毒復(fù)制過程中形成雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)中間體，可被細(xì)胞內(nèi)體膜上的Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)3識(shí)別，激活TANK結(jié)合激酶(TANK-binding kinase,TBK)1/核因子κB激酶抑制劑(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK)ε，進(jìn)而磷酸化IRF3/7轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，誘導(dǎo)I型IFN產(chǎn)生[6-7]?？滤_奇病毒(coxsackievirus,CVB)為單股正鏈小RNA病毒，在復(fù)制過程中生成大量dsRNA，因此，CVB可作為誘導(dǎo)I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化的有效誘導(dǎo)劑[8]，但其在病毒持續(xù)感染中對(duì)I型IFN的調(diào)控作用研究較少。博爾納病病毒(Borna disease virus,BDV)是一種有包膜的單負(fù)鏈RNA病毒，屬于嗜神經(jīng)病毒，能夠感染鳥類、家禽、牲畜和靈長類等多種動(dòng)物[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)BDV感染人后，主要引起以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為臨床體征的精神障礙性疾病[11]。多數(shù)情況下，BDV感染后會(huì)形成持續(xù)性的感染，被BDV感染的宿主細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、增殖能力及生物學(xué)特性上與正常細(xì)胞沒有明顯分別[12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)microRNA-155(miR-155)通過抑制I型IFN負(fù)性調(diào)控因子人細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子(human suppressor of cytokine signaling,SOCS)3表達(dá)促進(jìn)I型IFN產(chǎn)生，BDV編碼磷蛋白(phosphoprotein,P)通過調(diào)控miR-155抑制I型IFN建立病毒持續(xù)感染狀態(tài)[13]。因此，本研究以BDV持續(xù)感染的人類少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞(oligodendrocyte,OL)(OL/BDV)為研究模型，探討CVB在病毒持續(xù)感染狀態(tài)下對(duì)I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和質(zhì)粒 柯薩奇病毒B3型(CVB3)，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供，是CVB的6個(gè)血清型中致病性最強(qiáng)的一型。IRF7本身是IFN誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，存在于細(xì)胞漿中，其活性主要通過蛋白質(zhì)水平調(diào)節(jié)，許多因素如病毒感染和DNA損傷等能誘導(dǎo)IRF7磷酸化并促進(jìn)IRF7轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。IRF7-EGFP質(zhì)粒由澳大利亞墨爾本大學(xué)許大康教授惠贈(zèng)，轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)表達(dá)IRF7綠色熒光融合蛋白。

1.1.2 主要試劑與儀器 TRIzol、dNTP Mixture (each 2.5 mmol/L)、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，M-MLV購自美國Promega公司，Oligo d(T)18、SYBR Premix Ex TaqTM購自日本TaKaRa公司。Axiovert 200倒置熒光顯微鏡(ZEISS)，LightCycler 2.0熒光定量PCR儀(Roche)，-80 ℃低溫冰箱(SANYO)，TGL-16G高速冷凍離心機(jī)(HITACHI)，RS232C核酸分析儀(Eppendorf)，Mili-Q plus超純水系統(tǒng)(Milipore)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和病毒感染 選擇對(duì)數(shù)生長期的OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞，加入PBS緩沖液清洗細(xì)胞。加入0.25%的胰酶浸過細(xì)胞表面，37 ℃條件消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞收縮，細(xì)胞間隙增大，立即停止消化，棄去消化液。用適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以2.0×105細(xì)胞/孔鋪于12孔培養(yǎng)板內(nèi)。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于5% CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h，加入CVB(MOI:0.5)，分別于0、2、4、6、12和24 h收集細(xì)胞。按照Lipofectamine 2000操作說明書將IRF7-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后加入CVB感染4 h，熒光顯微鏡觀察IRF7的細(xì)胞定位情況。

1.2.2 RNA提取 上述操作中收集的細(xì)胞加入TRIzol，充分融化并混勻至液體無細(xì)胞團(tuán)塊。加入氯仿，充分混勻室溫靜置3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清移至新的無菌離心管中。加入異丙醇，充分混勻，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清。加入75%乙醇，輕輕漂洗沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清。開口倒置于無菌濾紙上，干燥核酸沉淀，加入去離子水溶解核酸沉淀，核酸分析儀檢測(cè)RNA濃度。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)取1.2.2操作中RNA 2 μg，加入隨機(jī)引物Oligo d(T)18、M-MLV、dNTP Mixture等逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，反應(yīng)條件為42 ℃ 1 h、95 ℃ 5 min。取cDNA 2 μL，分別加入GAPDH、IFN-α和IFN-β上下游引物[13]、SYBR Premix ExTaq、ddH2O，進(jìn)行qPCR檢測(cè)IFN-α mRNA和IFN-β mRNA相對(duì)表達(dá)水平。取1.2.2操作中RNA 2 μg，加入miR-155 RT引物[13]，逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。取cDNA 2 μL，分別加入U(xiǎn)6和miR-155上下游引物[13]，進(jìn)行qPCR檢測(cè)miR-155相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 CVB感染OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞I型IFN mRNA和miR-155表達(dá)水平的變化

2.1.1 I型IFN mRNA表達(dá)水平 CVB分別感染OL細(xì)胞0、2、4、6、12和24 h，其中4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2、4、12和24 h)IFN-α mRNA表達(dá)水平顯著增加(圖1A)，IFN-β mRNA表達(dá)水平在4、12和24 h顯著增加(圖1B)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，BDV持續(xù)感染顯著抑制OL細(xì)胞I型IFN的誘導(dǎo)表達(dá)[13]。CVB感染OL/BDV細(xì)胞6個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，IFN-α和IFN-β mRNA表達(dá)水平除0 h均顯著增加(圖1A和1B)，但是誘導(dǎo)作用顯著低于對(duì)OL細(xì)胞I型IFN的誘導(dǎo)作用，說明CVB僅能部分解除BDV對(duì)I型IFN誘導(dǎo)的抑制作用。

圖1 CVB感染OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞I型IFN mRNA表達(dá)水平的時(shí)間點(diǎn)分析Fig.1 Time point analysis of the expression of type I IFN mRNA in OL cells and OL/BDV cells infected with CVBA:CVB感染OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞后IFN-α mRNA的表達(dá)水平；B:CVB感染OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞后IFN-β mRNA的表達(dá)水平;與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，圖2同A:Expression of IFN- α mRNA in OL cells and OL/BDV cells infected with CVB;B.Expression of IFN-β mRNA in OL cells and OL/BDV cells infected with CVB:Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，the same as figure 2

2.1.2 miR-155表達(dá)水平 我們前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-155正性調(diào)節(jié)I型IFN表達(dá)，BDV持續(xù)感染顯著抑制OL細(xì)胞miR-155的產(chǎn)生[13]。因此，將CVB感染OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞后，于6個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞檢測(cè)miR-155的表達(dá)水平。由圖2可以看出，CVB在2、4、12和24 h顯著誘導(dǎo)OL細(xì)胞miR-155表達(dá)水平，4 h誘導(dǎo)水平最高。CVB僅在12和24 h增加OL/BDV細(xì)胞miR-155表達(dá)，誘導(dǎo)作用顯著低于對(duì)OL細(xì)胞miR-155的誘導(dǎo)作用，說明CVB僅在感染OL/BDV細(xì)胞后期促進(jìn)miR-155表達(dá)。

2.2 CVB感染OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞IRF7細(xì)胞定位的變化

2.2.1 CVB未感染細(xì)胞IRF7細(xì)胞定位情況 IRF7是I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子，轉(zhuǎn)染IRF7-EGFP質(zhì)粒至OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察IRF7綠色熒光蛋白于細(xì)胞中的定位情況，400倍視野進(jìn)行拍照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IRF7綠色熒光蛋白位于細(xì)胞漿內(nèi)(圖3A和3C)。

2.2.2 CVB感染細(xì)胞IRF7細(xì)胞定位情況 轉(zhuǎn)染IRF7質(zhì)粒至OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞，再加入CVB感染4 h，IRF7綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)(圖3B和3D)，說明CVB能夠活化IRF7，進(jìn)而激活I(lǐng)型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

圖2 CVB感染OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞miR-155表達(dá)水平的時(shí)間點(diǎn)分析Fig.2 Time point analysis of the expression of miR-155 in OL cells and OL/BDV cells infected with CVB

圖3 CVB感染OL細(xì)胞和OL/BDV細(xì)胞IRF7的細(xì)胞定位情況Fig.3 Cellular localization of IRF7 in OL cells and OL/BDV cells infected with CVBA:IRF7在OL細(xì)胞中的定位；B:CVB感染OL細(xì)胞IRF7的細(xì)胞定位；C:IRF7在OL/BDV細(xì)胞中的定位；D:CVB感染OL/BDV細(xì)胞IRF7的細(xì)胞定位A:Cellular localization of IRF7 in OL cells;B:Cellular localization of IRF7 in OL cells infected with CVB;C:Cellular localization of IRF7 in OL/BDV cells;D:Cellular localization of IRF7 in OL/BDV cells infected with CVB

3 討 論

RNA病毒常作為誘導(dǎo)劑用于I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究，常用的RNA病毒有流行性感冒病毒(influenza virus,Flu)、仙臺(tái)病毒(Sendai virus,SeV)和水皰性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)等。Qi等[14]研究發(fā)現(xiàn)Cdc25A能夠抑制Flu RNA對(duì)IFN-β螢光素酶報(bào)告基因的激活，并能抑制SeV等病毒誘導(dǎo)的IFN-β基因轉(zhuǎn)錄。登革病毒(dengue virus,DENV)感染后24和48 h，DDX 25沉默細(xì)胞的IFN-β表達(dá)較對(duì)照組分別增加1.5倍和1.4倍，DDX 25沉默也增強(qiáng)了IFN-β啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光素酶(IFNβ-Luc)在VSV和SeV感染的HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)[15]。miR-223在VSV感染的巨噬細(xì)胞中上調(diào)了Ⅰ型IFN的表達(dá)水平，由VSV感染誘導(dǎo)的I型IFN對(duì)miR-223的上調(diào)起著重要作用，從而形成了對(duì)Ⅰ型IFN產(chǎn)生的正調(diào)控回路[16]。本研究發(fā)現(xiàn)CVB顯著激活I(lǐng)型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并可增加病毒持續(xù)感染時(shí)I型IFN的產(chǎn)生，為CVB作為誘導(dǎo)I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的RNA病毒提供了參考。

BDV感染細(xì)胞后，常建立持續(xù)感染狀態(tài)，抑制I型IFN表達(dá)，因此BDV可作為病毒持續(xù)感染模型用來研究I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。BDV編碼蛋白P，可通過與TBK1發(fā)生相互作用影響IRF3的活化，即IRF3的磷酸化、二聚反應(yīng)以及入核，從而抑制IFN-β的合成[17]。還有研究發(fā)現(xiàn)，BDV編碼蛋白P降低神經(jīng)元細(xì)胞的組蛋白乙酰化水平，這種作用依賴于蛋白酶C對(duì)其磷酸化，BDV P同時(shí)抑制細(xì)胞組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，通過藥物調(diào)控細(xì)胞的乙?；胶?，細(xì)胞乙酰轉(zhuǎn)移酶降低了培養(yǎng)細(xì)胞中的病毒復(fù)制，說明BDV與宿主細(xì)胞相互作用建立持續(xù)感染狀態(tài)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)CVB能夠解除BDV對(duì)I型IFN的抑制作用，為進(jìn)一步研究病毒持續(xù)感染逃逸宿主免疫提供新的思路。

MiR-155位于人類的染色體(21q21.3)上，定位于GRCh37，參與多種生物學(xué)過程，如調(diào)控免疫細(xì)胞和造血細(xì)胞的分化及發(fā)育，參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，也能在病毒感染、炎癥和抗體合成等多種免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，RNA病毒誘導(dǎo)的miR-155表達(dá)能夠增強(qiáng)I型IFN的信號(hào)傳導(dǎo)途徑從而促進(jìn)I型IFN的抗病毒效應(yīng)。miR-155通過靶向結(jié)合I型IFN信號(hào)傳導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS1，從而增強(qiáng)I型IFN的信號(hào)傳導(dǎo)并促進(jìn)其抗病毒效應(yīng)[21]。而且，miR-155還能夠促進(jìn)人的肝癌細(xì)胞內(nèi)一些經(jīng)由I型IFN誘導(dǎo)的抗病毒蛋白產(chǎn)生增加，并且miR-155產(chǎn)生增加后使SOCS1蛋白的產(chǎn)生受到了抑制，從而激活了STAT1和STAT3的磷酸化，促進(jìn)I型IFN的JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)而增強(qiáng)天然抗病毒免疫反應(yīng)[22]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-155可以通過抑制IFN信號(hào)途徑中的負(fù)性調(diào)控因子SOCS3的表達(dá)來調(diào)控內(nèi)源性I型IFN的誘導(dǎo)過程。BDV編碼蛋白P利用減少宿主miR-155的產(chǎn)生而逃逸免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而建立了病毒的持續(xù)性感染[13]。本研究證實(shí)CVB顯著誘導(dǎo)OL細(xì)胞中miR-155表達(dá)，但是在BDV持續(xù)感染中僅在CVB感染后期誘導(dǎo)miR-155升高，可能是BDV對(duì)miR-155的抑制作用較強(qiáng)，而I型IFN的產(chǎn)生存在多條信號(hào)途徑的原因。

Zhong等[23]用酵母多糖(10 mg/mL)刺激小鼠巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞A6細(xì)胞8～24 h，IFN mRNA和蛋白表達(dá)水平在24 h前顯著升高，8 h達(dá)高峰，此外，Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN的表達(dá)水平與真菌性角膜炎的進(jìn)展呈正相關(guān)。通過設(shè)立6個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)CVB對(duì)I型IFN和miR-155的誘導(dǎo)作用，正常細(xì)胞4 h為誘導(dǎo)表達(dá)最顯著時(shí)間，BDV持續(xù)感染細(xì)胞24 h為誘導(dǎo)表達(dá)最顯著時(shí)間點(diǎn)，提示CVB對(duì)病毒未感染和持續(xù)感染時(shí)誘導(dǎo)I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的時(shí)間點(diǎn)可能存在不同。

RNA病毒感染及其復(fù)制過程中的dsRNA是誘導(dǎo)I型IFN產(chǎn)生的重要因子，在今后的研究中，如何合理地利用RNA病毒調(diào)控I型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，確保機(jī)體在病毒感染后啟動(dòng)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)來控制疾病的發(fā)生與發(fā)展是未來的研究方向。