何學(xué)虎，梁小燕，董 潔，趙倩穎，趙 玥，郭雅琪，師志云，張玉英，趙志軍*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，寧夏 銀川 750004；2.寧夏臨床病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004)

性傳播疾病(sexually transmitted diseases，STD)是指通過性行為傳播的一類疾病。淋球菌(Neisseriagonorrhoeae，NG)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，CT)和解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum，UU)是目前引起STD最常見的3種病原體，感染率逐年上升，與泌尿生殖系統(tǒng)感染及不孕不育、流產(chǎn)、早產(chǎn)等密切相關(guān)[1-4]，因此，對(duì)其感染進(jìn)行早期診斷及早期治療具有重要意義。為了解NG、CT、UU在寧夏地區(qū)泌尿生殖系統(tǒng)感染者中的感染特點(diǎn)，本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)2013年1月至2017年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的4 542例泌尿生殖系感染者棉拭子臨床樣本進(jìn)行檢測及分析，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 2013年1月至2017年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的4 542例泌尿生殖系感染無菌棉拭子標(biāo)本，男性3 561例，平均年齡(33.57±9.47)歲；女性981例，平均年齡(34.14±9.68)歲。

1.1.2 主要試劑 淋球菌核酸檢測試劑盒、沙眼衣原體核酸檢測試劑盒、解脲脲原體核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)均購自深圳凱杰生物工程有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 醫(yī)用冷藏箱(YC-300L，中科美菱)，醫(yī)用低溫箱(MDF-U548D-C，日本Panasonic)，生物安全柜(AS2-4S1，新加坡藝思高科技有限公司)，微量移液器(eppendorf，德國)，渦旋振蕩器(VORTEX-5，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，干式恒溫器(MK200-4，杭州奧盛儀器有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(Neofuge1600R，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)，熒光定量PCR儀(Rotor-Gene Q，德國Qiagen)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及保存 用無菌棉拭子伸入女性宮頸1～2 cm或男性尿道2～4 cm，停留數(shù)秒并旋轉(zhuǎn)2周后取出，立即放入無菌采樣管中密閉送檢，2～8 ℃保存不超過24 h，-20 ℃保存不超過3個(gè)月。

1.2.2 核酸提取 ①待測樣本：向含有無菌棉拭子的采樣管中加入1.5 mL無菌生理鹽水，渦旋震蕩充分漂洗，擠干棉拭子，將液體轉(zhuǎn)入1.5 mL無菌離心管，12 000 r/min離心5 min，吸棄上清(盡可能不碰沉淀)，沉淀中加入50 μL DNA提取液，渦旋震蕩充分混勻，瞬時(shí)離心后100 ℃干浴10 min，12 000 r/min離心5 min，保留上清備用；②質(zhì)控品：分別取陰性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品和強(qiáng)陽性質(zhì)控品各50 μL加入1.5 mL 無菌離心管，再加入50 μL DNA提取液，渦旋震蕩充分混勻，瞬時(shí)離心后100 ℃干浴10 min，12 000 r/min離心5 min，保留上清備用。

1.2.3 試劑準(zhǔn)備及加樣 每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)空白對(duì)照、陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性質(zhì)控。在試劑準(zhǔn)備區(qū)中將試劑盒中的PCR反應(yīng)液、HS-Taqplus酶和UNG酶取出，室溫融化，渦旋混勻，瞬時(shí)離心，按每人份33.3 μL PCR反應(yīng)液、0.7 μL HS-Taqplus酶和0.06 μL UNG酶配置反應(yīng)體系，渦旋混合，瞬時(shí)離心，按34 μL/人分裝至0.2 mL PCR反應(yīng)管，轉(zhuǎn)移至標(biāo)本制備區(qū)，加入6 μL核酸(空白對(duì)照直接加入6 μL DNA提取液)，蓋緊管蓋。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)PCR儀上，記錄樣本擺放順序，運(yùn)行程序：37 ℃ 5 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s(40個(gè)循環(huán))，反應(yīng)體系40 μL，60 ℃收集熒光。

1.2.5 結(jié)果分析 所有結(jié)果均在質(zhì)控在控的情況下判讀，即空白對(duì)照、陰性質(zhì)控測定結(jié)果為陰性(無Ct值或Ct值等于40)，弱陽性質(zhì)控測定結(jié)果為陽性(26≤Ct值≤32)，強(qiáng)陽性質(zhì)控測定結(jié)果為陽性(Ct值≤25)。當(dāng)樣本無Ct值或Ct值等于40，判為陰性；當(dāng)37<樣本Ct值<40，則視灰度區(qū)，應(yīng)進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果Ct值<40，判為陽性，否則判為陰性；當(dāng)樣本Ct值≤37，判定為陽性。再分別統(tǒng)計(jì)NG、CT、UU總體感染情況，NG、CT、UU混合感染類型及分布，不同年齡段NG、CT、UU感染情況以及不同年份間NG、CT、UU感染情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NG、CT、UU總體感染情況

檢出3種病原體陽性共1 204例，總陽性率為26.51%(1 204/4 542)，NG、CT、UU單一病原體陽性率分別為26.31%(362/1 376)、15.21%(214/1 407)和35.70%(628/1 759)。男性陽性率為23.48%(836/3 561)，女性陽性率為37.51%(368/981)，陽性率有性別差異(P<0.01)。NG、CT陽性率男性顯著高于女性(P<0.05)，UU陽性率女性顯著高于男性(P<0.01)(表1、圖1A)。

表1 NG、CT、UU總體感染情況Table 1 Overall infection of NG，CT and UU

2.2 NG、CT、UU混合感染類型及分布

4 542例患者中共檢出NG、CT、UU不同類型的混合感染陽性者151例，陽性率為3.32%(151/4 542)，男、女性混合感染率分別為3.82%(136/3 561)和1.53%(15/981)，混合感染率有性別差異(P<0.01)?；旌细腥绢愋椭校行躁栃月视筛叩降鸵来螢镃T+UU、NG+UU、NG+CT、NG+CT+UU；女性陽性率由高到低依次為CT+UU、NG+UU、NG+CT+UU、NG+CT?？傮w上混合感染類型以CT+UU和NG+UU為主，CT+UU與其他混合感染類型比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2、圖1B)。

表2 不同性別間NG、CT、UU混合感染情況比較Table 2 Comparison of NG，CT and UU mixed infection among different genders

注：a表示與CT+UU感染率比較；b表示男女性之間總體混合感染率比較

2.3 不同年齡段間感染NG、CT、UU陽性率比較

不考慮性別因素，總陽性率以≤20歲年齡段最高，與其他年齡段比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，NG和CT陽性率隨年齡段的增加而減低，UU陽性率呈先降低后增加再降低趨勢(shì)?？紤]性別因素，男性患者總陽性率、NG和CT陽性率隨年齡段的增加而減低，UU陽性率呈先降低后增加再降低趨勢(shì)。女性患者總陽性率以21～30歲年齡段最高，其次為31～40歲年齡段，隨年齡段的增加，NG、CT陽性率呈降低趨勢(shì)，UU陽性率呈先降低后增加再降低趨勢(shì) (表3、圖2)。

圖1 NG、CT、UU單一感染和混合感染情況Fig.1 Single infection and mixed infection of NG，CT and UU*P<0.05；**P<0.01

表3 不同年齡段間NG、CT、UU感染情況比較Table 3 Comparison of NG，CT and UU infection among different age groups

注：*表示與≤20歲年齡段比較，P<0.01

圖2 不同年齡段NG、CT、UU感染情況Fig.2 Infection of NG，CT and UU in different age groups

2.4 不同年份間感染NG、CT、UU陽性率比較

2013至2017年，不考慮性別因素，NG、CT、UU及總感染率呈上升趨勢(shì)。考慮性別因素，男性NG、CT、UU及總感染率均呈上升趨勢(shì)；女性NG、CT感染率呈下降趨勢(shì)，UU感染率呈上升趨勢(shì)，總感染率呈上升趨勢(shì)(表4、圖3)。

表4 不同年份間NG、CT、UU感染情況比較Table 4 Comparison of NG，CT and UU infection among different years

注：*表示與2013年比較，P<0.01

圖3 不同年份NG、CT、UU感染情況Fig.3 Infection of NG，CT and UU in different years

3 討 論

STD指通過性接觸而感染的疾病，主要病變發(fā)生在生殖器部位。NG、CT、UU是STD中最常見的病原體，感染NG、CT、UU可引起泌尿生殖系感染，嚴(yán)重危害生殖健康[5]。人類是NG惟一的天然宿主，普遍缺乏對(duì)NG的自然免疫力，NG可通過性接觸侵入泌尿生殖系統(tǒng)繁殖而引起化膿性感染，導(dǎo)致淋菌性尿道炎、盆腔炎、宮頸炎、散播性淋病等相關(guān)疾病[6]，此外，胎兒可經(jīng)產(chǎn)道感染造成新生兒淋病性急性結(jié)膜炎[7]。CT專性寄生于活細(xì)胞內(nèi)，可引起男性尿道炎和附睪炎，女性宮頸炎和盆腔炎等疾病，其感染具有無癥狀攜帶者多、易傳播、流行率高等特點(diǎn)[8-9]。UU是一種條件致病微生物，也是迄今為止能獨(dú)立生活和繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物，可寄居于人類泌尿生殖系統(tǒng)引起非淋菌性尿道炎、男女性生殖系統(tǒng)感染，并與不育、早產(chǎn)、流產(chǎn)、低體重胎兒等疾病相關(guān)[10-11]。

目前，傳統(tǒng)的病原體檢測方法主要有涂片鏡檢、病原體特異性抗原檢測、血清學(xué)試驗(yàn)、病原體的分離培養(yǎng)和鑒定等，但上述方法具有主觀性強(qiáng)、敏感性低、檢測周期長、操作繁瑣、不易被檢出等缺點(diǎn)，給臨床診斷帶來困難。熒光定量PCR技術(shù)(Fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)在閉管狀態(tài)下進(jìn)行擴(kuò)增和分析，能大大減少擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，F(xiàn)Q-PCR檢測NG、CT和UU的最低檢測限達(dá)500 copies/mL，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便、檢驗(yàn)周期短、檢出率高等顯著優(yōu)勢(shì)，能及時(shí)準(zhǔn)確地提供檢測數(shù)據(jù)輔助臨床診斷，因而成為目前臨床檢驗(yàn)診斷中的常用方法[12]；與此同時(shí)，每次檢測設(shè)定的空白對(duì)照、陰性質(zhì)控、弱陽性和強(qiáng)陽性質(zhì)控則進(jìn)一步保證了陽性結(jié)果的可靠性。但是，F(xiàn)Q-PCR檢測的是病原體核酸，并不能區(qū)分活菌和死菌，也無法檢測出因病原體基因變異而出現(xiàn)的假陰性。對(duì)假陰性而言，理論上應(yīng)用“金標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)法進(jìn)行驗(yàn)證，但因臨床上有對(duì)培養(yǎng)基中萬古霉素敏感的菌株，加之存在不合理用藥現(xiàn)象，“金標(biāo)準(zhǔn)”也可能存在假陰性[13]。因此，建議患者在治療前或停藥治療兩周后再行FQ-PCR法檢測NG、CT和UU。

本研究中3種病原體總感染率為26.51%(1 204/4 542)，普遍低于國內(nèi)報(bào)道的62.8%和64.18%[14-15]；據(jù)報(bào)道，北京和廣州地區(qū)NG、CT、UU感染率分別為3.11%、7.49%、42.92%和3.0%、8.0%、45.4%[16-17]，本研究NG、CT、UU感染率分別為26.31%、15.21%和35.70%，NG、CT感染率高于北京和廣州地區(qū)，UU感染率低于上述兩地；結(jié)果顯示，男性感染率(23.48%)低于女性(37.51%)，可能與男性癥狀明顯、主動(dòng)就醫(yī)率高、就診及時(shí)，女性癥狀復(fù)雜、主動(dòng)就醫(yī)率低、延誤治療有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)感染率有性別差異，NG、CT感染率男性顯著高于女性，UU感染率女性顯著高于男性，與李東等[18]的報(bào)道基本一致，但與王敬仁等[19]的報(bào)道卻不同；證實(shí)性傳播疾病的流行存在一定的地區(qū)差異性，可能與教育程度、醫(yī)療條件、當(dāng)?shù)貧夂蛞约懊褡逦幕纫蛩赜嘘P(guān)。

本調(diào)查中3種STD病原體混合感染151例，感染率為3.32%(151/4 542)，男女混合感染率有性別差異，其中3 561例男性中混合感染136例，感染率為3.82%(136/4 542)，981例女性中混合感染15例，感染率為1.53%(15/981)；無論男性還是女性，混合感染類型均以CT+UU為主、NG+UU次之，與文獻(xiàn)報(bào)道的混合感染類型及分布相符[20]，但本研究混合感染率低于文獻(xiàn)報(bào)道，其原因除了地區(qū)差異之外還可能與并非所有患者都同時(shí)檢測3種STD病原體而造成一定數(shù)量的漏檢有關(guān)，加之混合感染比單一感染危害更大，提示臨床在診療過程中應(yīng)同時(shí)檢測3種病原體以防漏檢而錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)延誤病情。

不同年齡段感染情況顯示，不考慮性別因素，≤20歲年齡段感染率最高，21～40歲年齡段次之，隨著年齡段的增加，感染率逐漸降低；考慮性別因素，男性≤20歲年齡段感染率最高，21～40歲次之，女性21～40歲年齡段感染率最高，≤20歲年齡段次之；與國外報(bào)道的20～45歲年齡段是STD高發(fā)人群不同[21]，本研究≤20歲年齡段占比最高，且與其他年齡段比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示除了將正處于性活躍及生殖高峰期的21～40歲青壯年列為主要傳染源和高危人群外，還應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)≤20歲人群的健康教育、性傳播防護(hù)和體檢工作，將其一并作為STD防治工作中的重點(diǎn)對(duì)象。

不同年份間感染情況顯示，不考慮性別因素，總感染率及NG、CT、UU單一感染率呈上升趨勢(shì)；考慮性別因素，男性總感染率及NG、CT、UU單一感染率也呈上升趨勢(shì)，女性總感染率呈上升趨勢(shì)，NG、CT感染率呈下降趨勢(shì)，UU感染率呈上升趨勢(shì)。數(shù)據(jù)證實(shí)，2013至2017年，無論總感染率還是3種STD病原體單一感染率均呈上升趨勢(shì)，并且2014、2015、2017年感染率與2013年相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與張欠欠等[22]報(bào)道的2011至2015年3種STD病原體感染率呈上升趨勢(shì)結(jié)果一致。

綜上所述，STD患者中NG、CT、UU及總感染率較高，而且感染呈年輕化、逐年上升趨勢(shì)，在一定程度上已經(jīng)造成流行。分析其原因可能有不潔性行為、不了解或不重視STD知識(shí)致使個(gè)人防護(hù)不夠、因癥狀較輕而忽視未及時(shí)得到治療、隱瞞病情造成治療困難、病原體之間的混合感染、抗生素濫用使病原體產(chǎn)生耐藥。因此，首先應(yīng)加強(qiáng)對(duì)人群的健康教育和科學(xué)知識(shí)的普及，使其正確認(rèn)識(shí)STD和性行為，提倡潔身自愛；其次，對(duì)STD患者應(yīng)同時(shí)檢測多種病原體以明確診斷，力求早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療；再次，對(duì)不同地區(qū)、不同性別以及不同年齡段的高危人群進(jìn)行定期體檢和監(jiān)測，全方位多角度地從源頭上控制傳播，減少對(duì)健康的危害。

本文回顧性分析研究顯示，2013至2017年泌尿生殖系感染者中NG、CT、UU感染情況嚴(yán)重，感染率呈逐年上升趨勢(shì)、感染年齡呈年輕化趨勢(shì)；考慮性別因素，男性易感NG和CT，女性易感UU，因此，應(yīng)提高警惕積極防治；同時(shí)，混合感染也較常見，提示泌尿生殖系感染者應(yīng)同時(shí)檢測多種STD病原體以防漏檢。