馬連君 周乃康 祁彥君 劉慧峰 趙亞超 鄭夢利

射頻消融（radiofrequency ablation, RAF）是通過射頻電流引起離子振蕩和極性生物大分子極性轉(zhuǎn)換，造成摩擦，使靶區(qū)組織升溫，導(dǎo)致凝固性壞死的一種局部熱損毀手段，具有操作方便、創(chuàng)傷小、恢復(fù)快的特點(diǎn)[1]。在胸部惡性腫瘤領(lǐng)域，RFA主要用于不能耐受手術(shù)的早期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移腫瘤的治療[2]。隨著RFA應(yīng)用的普及，人們發(fā)現(xiàn)殘存腫瘤細(xì)胞是影響其遠(yuǎn)期療效的最主要因素[3,4]，RFA聯(lián)合鉑類藥物化療是減少術(shù)后腫瘤細(xì)胞殘存的有效手段之一，但在具體的結(jié)合模式方面，尚缺乏統(tǒng)一認(rèn)識[5,6]。近年來，人們對RFA治療后殘存腫瘤細(xì)胞的一些生物學(xué)特性改變進(jìn)行了深入研究[7-10]。ERCC1表達(dá)情況常用作肺癌對鉑類化療藥物敏感性的預(yù)測指標(biāo)，也用作肺癌患者預(yù)后指標(biāo)[11]，目前尚無肺腫瘤RFA治療后殘存腫瘤細(xì)胞ERCC1表達(dá)情況的研究報(bào)道。兔VX2腫瘤源于Shop病毒誘導(dǎo)的兔乳頭狀瘤衍生鱗癌，有高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性，可在多種兔子、多種臟器建立移植瘤模型[12]。為此，我們采用免疫組織化學(xué)方法對RFA治療后兔肺內(nèi)殘存VX2鱗癌細(xì)胞ERCC1表達(dá)情況進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 荷瘤動(dòng)物模型制備和分組 70只健康純種新西蘭白兔，3月-4月齡，體重2.0 kg-2.5 kg，雌雄不限（由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；肌肉注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，右胸壁脫毛，采用組織塊懸液肺內(nèi)注射法[12]建立VX2鱗癌肺內(nèi)移植瘤模型（VX2鱗癌細(xì)胞株由解放軍總醫(yī)院腫瘤中心提供）；然后隨機(jī)分為對照組10只，RFA組60只。RFA組再按時(shí)間分為0 d（即時(shí)）、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d共6個(gè)組，每組10只。

1.2 RFA治療和取材 待新西蘭白兔肺內(nèi)VX2鱗癌生長至最大徑超過10 mm后進(jìn)行RFA治療。以前述方法麻醉，3 mm層厚連續(xù)胸部CT掃描定位，置入10針集束電極，確認(rèn)其尖端位于腫瘤中心后，控制電極展開直徑不超過8 mm。開啟RF2000型射頻機(jī)（RadiotherapeuticTM公司生產(chǎn)），起始輸出功率為30 W，每分鐘升高10 W，最高輸出功率60 W，治療4 min，退出電極。CT掃描有無血、氣胸發(fā)生，并及時(shí)進(jìn)行胸腔穿刺治療。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，并肌肉注射青霉素160萬單位/天（0 d-3 d）。各RFA組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死，取凝固性壞死邊界內(nèi)外各3 mm的腫瘤組織，4%中性甲醛固定后，常規(guī)制備石蠟切片，HE染色觀察，以同時(shí)含有凝固性壞死腫瘤和殘存腫瘤的組織為合格標(biāo)本，否則為不合格標(biāo)本。對照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物僅置入并展開電極，不進(jìn)行RFA治療即處死，取周邊的腫瘤組織作為研究標(biāo)本。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 對照組和RFA組合格標(biāo)本的石蠟塊連續(xù)4 μm厚切片，按Envision法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。即用型鼠抗兔ERCC1單克隆抗體（克隆號：8F1）及免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。以提供的陽性切片在同一條件下染色作為陽性對照，用PBS替代一抗作為陰性對照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，以細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每例標(biāo)本在400倍光鏡下選取5個(gè)有代表性的區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，共計(jì)數(shù)500個(gè)-1,500個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，腫瘤細(xì)胞ERCC1表達(dá)的陽性百分率采用Mean±SD表示，各RFA組均同對照組進(jìn)行比較，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)和P值均為雙側(cè)。

2 結(jié)果

2.1 合格標(biāo)本數(shù)量 RFA組共獲得48例合格標(biāo)本。在12例不合格標(biāo)本中，7例因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物死于RFA并發(fā)癥未達(dá)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)而剔除（大量氣胸2例，大量血胸1例，廣泛肺不張4例）；其余5例因HE染色未見殘存腫瘤細(xì)胞，不符合本實(shí)驗(yàn)要求而剔除。

2.2 殘存腫瘤的分布 對RFA組合格標(biāo)本HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)殘存VX2鱗癌細(xì)胞位于凝固性壞死灶周邊，成片存在（圖1）；在凝固性壞死灶內(nèi)較大血管周圍偶見殘存腫瘤細(xì)胞；凝固性壞死灶的其它區(qū)域未見殘存腫瘤細(xì)胞。

2.3 ERCC1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 對照組腫瘤細(xì)胞以及RFA組殘存腫瘤細(xì)胞均見ERCC1表達(dá)（圖2），而凝固性壞死的腫瘤細(xì)胞未見ERCC1表達(dá)。對照組（n=10）腫瘤細(xì)胞ERCC1表達(dá)陽性率為32.9%±2.5%；1 d（n=7）、3 d（n=6）、5 d（n=8）組殘存腫瘤細(xì)胞的ERCC1表達(dá)陽性率分別為50.7%±1.4%、53.7%±1.6%和36.9%±2.5%，明顯高于對照組（P＜0.05），尤其以3 d組最高（t=18.23, P＜0.001）；而0 d（n=9）、7 d（n=10）、14 d（n=8）組的殘存腫瘤細(xì)胞ERCC1表達(dá)陽性率分別為31%±2.1%、33.7%±1.4%和32.8%±1.4%，同對照組比較無明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

圖 1 兔肺內(nèi)VX2鱗癌RFA治療后的殘存腫瘤細(xì)胞和凝固性壞死腫瘤細(xì)胞（HE,×100）。白色箭頭：凝固性壞死的腫瘤細(xì)胞；黑色箭頭：殘存腫瘤細(xì)胞。Fig 1 Residual cells and coagulation necrosis cells of VX2 squamous carcinoma in rabbit lung after RFA (HE, ×100). Black arrows: residual cells; White arrows: coagulation necrosis cells. RFA: radiofrequency ablation.

肺內(nèi)腫瘤RFA治療效果同肺的組織學(xué)特點(diǎn)密切相關(guān)。由于大量氣體的存在，導(dǎo)致肺內(nèi)電傳導(dǎo)和熱傳導(dǎo)的效應(yīng)遠(yuǎn)低于其它實(shí)質(zhì)性臟器；另外，在肺腫瘤周邊持續(xù)存在的血流、氣流又造成明顯的“散熱效應(yīng)”。這兩種因素導(dǎo)致RFA靶區(qū)周邊以及靶區(qū)內(nèi)部較大血管周圍容易形成腫瘤殘存[13]。雖然，近年通過改良電極等手段擴(kuò)大了消融范圍，但殘存腫瘤問題仍沒有得到根本解決[4]，肺內(nèi)惡性腫瘤RFA治療后殘存腫瘤發(fā)生率為12%-40%[1]。在本研究中，我們通過控制電極展開范圍、輸出功率和治療時(shí)間的方法，建立了兔VX2鱗癌肺移植瘤RFA治療后的殘存腫瘤模型。通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，這種模型的殘存腫瘤細(xì)胞大多位于凝固性壞死灶的周圍，在較大血管周圍發(fā)現(xiàn)少量的殘存腫瘤細(xì)胞，這一結(jié)果同其它文獻(xiàn)報(bào)道[1,4,13,14]相吻合。采用這種方法建立的兔肺內(nèi)腫瘤RFA后殘存腫瘤模型，方法簡單、安全，成功率高，能夠很好的模擬RFA后肺內(nèi)殘存腫瘤的實(shí)際狀態(tài)，為相關(guān)研究提供了合適的平臺。

圖 2 RFA治療后兔肺內(nèi)殘存VX2鱗癌細(xì)胞ERCC1的表達(dá) (IHC, ×400)Fig 2 ERCC1 expression of in residual VX2 squamous carcinoma cells in rabbit lung after RFA (IHC, ×400)

RFA治療后殘存腫瘤對于肺腫瘤患者遠(yuǎn)期生存率的影響很大。von Meyenfeldt等[14]報(bào)道肺轉(zhuǎn)移瘤患者RFA治療后有腫瘤殘存者3年生存率為49%，而無腫瘤殘存者3年生存率為79%。近年來，人們嘗試聯(lián)合含鉑類藥物化療，以減少RFA治療后殘存腫瘤細(xì)胞，提高治療效果，但是在鉑類藥物給藥時(shí)機(jī)方面尚缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識[5,6]。鉑類藥物通過造成DNA鏈間交聯(lián)引發(fā)的一系列反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這種DNA鏈間交聯(lián)可以被細(xì)胞內(nèi)的核酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair, NER）機(jī)制清除，從而修復(fù)鉑類藥物造成的DNA損傷，消弱其細(xì)胞毒性，導(dǎo)致耐藥。ERCC1是NER的限速酶，是公認(rèn)的反映NER功能的生物標(biāo)記物，臨床上常作為判斷腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物敏感性的標(biāo)志物使用[11]。Olaussen等[15]經(jīng)對761例NSCLC手術(shù)標(biāo)本的ERCC1表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)后含鉑類藥物化療能延長ERCC1低表達(dá)患者的生存，但對于ERCC1高表達(dá)的患者無益處；并且ERCC1高表達(dá)可能意味著對鉑類耐藥。另一方面，ERCC1表達(dá)情況與NSCLC患者的預(yù)后也密切相關(guān)[16,17]，ERCC1高表達(dá)的患者預(yù)后好于ERCC1低表達(dá)的患者，其原因是ERCC1低表達(dá)提示NER功能低下，容易導(dǎo)致DNA損傷積累增加，故患者預(yù)后差；而ERCC1高表達(dá)則相反。近期的一些研究[7-10]發(fā)現(xiàn)RFA治療后殘存腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移能力發(fā)生了改變，但關(guān)于ERCC1表達(dá)變化的研究尚未見報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測了RFA治療后兔肺內(nèi)VX2鱗癌殘存腫瘤細(xì)胞ERCC1表達(dá)，結(jié)果顯示在RFA治療后1 d-5 d內(nèi)殘存腫瘤細(xì)胞ERCC1表達(dá)明顯高于對照組水平，5 d后降至對照組水平。這一現(xiàn)象提示肺內(nèi)殘存的VX2鱗癌細(xì)胞受亞致死性熱損傷后NER功能增強(qiáng)，這可能是一種自身保護(hù)性反應(yīng)[18]，但這種反應(yīng)的可能導(dǎo)致鉑類藥物的細(xì)胞毒性下降，影響化療效果。結(jié)合Olaussen等[15]的研究結(jié)果，我們認(rèn)為在RFA治療后5 d內(nèi)給予鉑類藥物化療，可能效果不佳。另外，因在RFA治療5 d后兔肺內(nèi)殘存VX2鱗癌細(xì)胞ERCC1表達(dá)陽性率降至對照組水平，故從判斷預(yù)后角度看，無明顯影響。

本研究僅是在動(dòng)物模型上進(jìn)行的肺內(nèi)腫瘤RFA治療后殘存腫瘤ERCC1表達(dá)改變的初步探索，對于判斷RFA治療后鉑類藥物化療時(shí)機(jī)還存在一定的局限性和不足之處。肺內(nèi)腫瘤有多種細(xì)胞類型，而本研究僅為一種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故有待其它類型腫瘤細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床治療研究的佐證。另外，影響鉑類藥物化療效果的因素還有很多，比如RFA治療后殘存腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期改變、腫瘤局部血液供應(yīng)改變等，故在這些方面還需要深入研究。