張其剛 齊科雷 曲曉翰 許廣輝 劉洋 楊焱淼

MG是一種以骨骼肌無力為主要表現(xiàn)，由乙酰膽堿受體抗體介導的針對神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜乙酰膽堿受體的自身免疫性疾病［1］。胸腺是觸發(fā)并維持這種自身免疫反應的場所，T淋巴細胞免疫異常在MG發(fā)病中占有重要地位。本研究通過檢測胸腺瘤患者血清和胸腺淋巴細胞Fas表達變化以及基因結構改變，對MG的發(fā)病機制進行研究和探討。

1 對象和方法

1.1 觀察對象 收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科2000-01-01－2011-12-30 期間收治的胸腺瘤手術患者共131例，按是否合并MG分兩組。MG患者均以典型臨床癥狀加新斯的明試驗和肌電圖檢查陽性作為確診依據(jù)［2］，并通過病史和相關檢驗如甲狀腺功能檢測、血細胞分析等排除MG以外的其他自身免疫性疾病。（1）胸腺瘤合并MG組：70例，其中男30例、女40例，平均年齡42.2歲。其中按WHO胸腺瘤病理分型，A型15例，AB型12例，B1型20例，B2型14例，B3型9例；按Masaoka胸腺瘤臨床分期，Ⅰ期27例，Ⅱ期24例，Ⅲ期14例，Ⅳa期5例；按Osserman MG臨床分型，Ⅰ型25例，Ⅱa型20例，Ⅱb型16例，Ⅲ型7例，Ⅳ型2例。（2）胸腺瘤不合并MG組：61例，男30例、女31例，平均年齡45.6歲。其中按WHO胸腺瘤病理分型，A型13例，AB型13例，B1型17例，B2型12例，B3型6例；按 Masaoka胸腺瘤臨床分期，Ⅰ期26例，Ⅱ期21例，Ⅲ期11例，Ⅳa期3例。胸腺瘤合并 MG組患者除 MG外，不合并其他自身免疫性疾病，胸腺瘤不合并MG組患者不合并任何自身免疫性疾病。兩組年齡、性別、胸腺瘤病理分型及臨床分期等差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 方法

1.2.1 血清sFas檢測：術晨空腹采集患者肘靜脈血4mL，無抗凝，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組血清sFas水平。

1.2.2 胸腺淋巴細胞Fas檢測：切除胸腺組織常規(guī)制作石蠟標本切片以SP法免疫組織化學染色［3］，觀察兩組胸腺淋巴細胞Fas表達狀況。胞膜或胞質(zhì)被染成棕黃色者為Fas表達陽性細胞。采集免疫組化圖像（400倍）輸入到顯微圖像分析儀，利用計算機圖像分析系統(tǒng)測定兩組病例胸腺淋巴細胞Fas染色程度積分灰度值，積分灰度值越大，提示Fas蛋白表達量越高。

1.2.3 Western blot檢測Fas蛋白表達：取術中獲取新鮮胸腺組織，去筋膜和血污，剪碎過80目無菌不銹鋼網(wǎng)，制成胸腺單細胞懸液，再經(jīng)淋巴細胞分離液分離出胸腺淋巴細胞，制成胸腺淋巴細胞懸液備用。取胸腺淋巴細胞懸液，以細胞裂解緩沖液裂解細胞，離心提取上清，電泳，應用100bp梯度Markers作為相對分子質(zhì)量（Mr）大小對照，確定目的條帶（Mr 45 000），剔除其他蛋白條帶，將目的條帶轉(zhuǎn)膜，PBS洗膜，ECL顯色，UVP凝膠成像，應用凝膠成像儀，進行成像分析，測定兩組目的條帶的灰度值，與內(nèi)參GAPDH（Mr 37000）的灰度值進行比較，該比值作為每個標本Fas蛋白相對表達量。相對表達量越大，提示Fas蛋白表達量越高。

1.2.4 RT-PCR 法檢測 Fas mRNA 表達：采用Trizol試劑一步法提取胸腺淋巴細胞總RNA，按superscriptⅡTM試劑盒說明以RNA為模板，Oligo5.0為引物進行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫中Fas mRNA序列設計1-9外顯子的引物［4］，以cDNA第一鏈為模板行PCR擴增（95℃1min，56.5℃1 min，72℃1min，共30個循環(huán)）。Fas上游引物5′－ATGCTGGGCATCTGGACCCT-3′，下游引物5′－CACTCTAGACCAAGCTTTGG-3′，擴增片段長度為 1011bp，β-actin 上 游引 物 5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3′，下 游 引 物 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3′，擴增片段長度472bp。Fas和β-actin兩個反應體系的產(chǎn)物與 Marker再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，紫外線下成像。β-actin為根據(jù)Genbank提供的Fas mRNA序列而設計的mRNA內(nèi)參照序列，Marker為100bp梯度的序列標記mRNA，兩者一起用于確定Fas mRNA目的條帶。應用凝膠成像儀，進行成像分析，測定兩組目的條帶的灰度值，與β-actin灰度值進行比較，該比值作為每個標本Fas mRNA的相對表達量。相對表達量越大，提示Fas mRNA表達量越高。

1.2.5 Fas基因測序分析：隨機選取兩組胸腺淋巴細胞懸液各20例，按試劑盒操作提取基因組DNA，測D（λ）260nm值。D（λ）260nm值為1相當于50 μg／mL雙鏈DNA，據(jù)此計算所提取的DNA濃度，確定為配制反應體系時加入量。根據(jù)GeneBank查找的Fas基因序列［4］，分別設計各個外顯子的引物，PCR擴增（94℃3min，94℃30s，72℃2min，共30循環(huán)，之后72℃5min）。取擴增后樣本15 μL，Marker 3μL，加入loading buffer 3μL，混勻，電泳，根據(jù)GeneBank中查到的Fas基因1-9外顯子分子量和100bp梯度Marker標記確定外顯子目的條帶，作為PCR產(chǎn)物原液，送TIANGEN公司測序，測序結果經(jīng)過chomas145-95軟件分析，有差異者須再經(jīng)過3次雙向測序證實為異常堿基而非隨機誤差。將測得序列再與GENEBANK上的Fas基因外顯子序列進行對比并結合單核苷酸多態(tài)性進行氨基酸變異情況分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0軟件分析。兩組所測得的實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清sFas水平 胸腺瘤合并MG組，血清sFas水平為（3879.06±706.51）pg／mL，明顯高于胸腺瘤不合并 MG組（1868.18±391.46）pg／mL（t＝63.19，P＜0.05）。

2.2 胸腺淋巴細胞Fas表達 胸腺瘤合并 MG組胸腺組織內(nèi)淋巴細胞Fas蛋白染色程度與上皮細胞相比明顯減弱（圖1A），胸腺瘤不合并MG組胸腺組織內(nèi)兩種細胞Fas蛋白染色程度基本相同（圖1B）。胸腺瘤合并MG組淋巴細胞染色積分灰度值（9.16±3.13）高于胸腺瘤不合并 MG 組（36.56±5.83）（t＝14.539，P＜0.05）。

2.3 胸腺淋巴細胞Fas蛋白表達 胸腺瘤合并MG組Fas蛋白相對表達量為1.47±0.35，明顯低于胸腺瘤不合并 MG 組（3.67±0.55）（t＝18.58，P＜0.001）（圖2）。

2.4 胸腺淋巴細胞Fas mRNA表達 胸腺瘤合并 MG組Fas mRNA相對表達量為1.39±0.34，明顯低于胸腺瘤不合并 MG組（2.49±0.32）（t＝13.10，P＜0.001）（圖3）。

圖1 兩組患者胸腺Fas表達（SP法×400）

圖 2 兩組胸腺瘤患者胸腺淋巴細胞Fas蛋白表達差異（Mr 45 000，Western blot）

圖 3 兩組胸腺淋巴細胞Fas mRNA表達（RT-PCR）

圖 4 Fas基因第3、6、7號外顯子測序截圖（圖中箭頭所示為突變的位點）

2.5 Fas基因測序 兩組患者胸腺淋巴細胞均檢測到Fas基因第3、6、7外顯子堿基置換突變發(fā)生（圖4）。其中3號和7號外顯子各有一個突變位點，分別為G→A和T→C堿基置換突變，但不改變編碼氨基酸的類型，兩組發(fā)生概率基本相同。6號外顯子共發(fā)現(xiàn)有5個突變位點，其中3個位點（7、20、60位點）分別為G→A、T→G和T→G突變，發(fā)生率兩組基本相同，在5%～15%之間；另兩個位點（16、21位）均為T→G突變，所編碼氨基酸分別發(fā)生 TTG（Leu，亮氨酸）→TGG（Trp，色氨酸）和TGG（Trp）→GGG（Gly，甘氨酸）改變，胸腺瘤合并MG組發(fā)生率分別為65%和75%，均高于胸腺瘤不合并 MG組的發(fā)生率（均為5%）（t＝15.12，P＜0.05）。

3 討論

MG患者機體存在體液和細胞免疫功能異常，多有胸腺增生或胸腺瘤等胸腺的病理改變［5］。約50%～70%的胸腺瘤患者合并不同程度MG。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，Masaoka臨床分期或WHO病理分型相同的胸腺瘤患者，有的合并不同分型的MG，有的卻不合并任何自身免疫性疾病，提示胸腺瘤分型和分期與MG無明確相關性，或相關性不明顯［6］。本研究中作者收集兩組不同病理分型和臨床分期的胸腺瘤患者，檢測并比較各自胸腺的病理改變，探討其胸腺內(nèi)淋巴細胞結構和免疫功能改變是否與MG發(fā)病有關。

胸腺是中樞免疫器官，前T淋巴細胞在此先分化形成CD4＋CD8＋雙陽性細胞，再分別經(jīng)陽性選擇、細胞凋亡和陰性選擇等，最終形成功能性淋巴細胞［7］，其中淋巴細胞凋亡對維持機體內(nèi)環(huán)境及免疫功能的穩(wěn)定，防止自身免疫性疾病的發(fā)生極具重要意義，而胸腺淋巴細胞陰性選擇與Fas介導的細胞凋亡密切相關［8］。Fas屬于腫瘤壞死因子／神經(jīng)生長因子受體家族成員，分布于淋巴細胞表面，主要以膜分子（mFas）形式存在，少部分呈可溶性（sFas）形式。mFas是功能完整的跨膜糖蛋白，表達于淋巴細胞膜和胞質(zhì)，sFas是編碼mFas mRNA發(fā)生拼接變異時產(chǎn)生的少量缺乏跨膜區(qū)域的結構變異Fas［9］。人Fas基因包括9個外顯子，外顯子2-5編碼膜外端，外顯子6編碼跨膜區(qū)，外顯子7－9編碼膜內(nèi)端。有文獻報導Fas缺陷的突變鼠和人類易患淋巴細胞增生性疾?。↙Pr）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）等自身免疫性疾?。?0］，說明異常的細胞凋亡在自身免疫性疾病發(fā)病中具有重要地位，淋巴細胞凋亡缺陷主要與Fas基因調(diào)控異常有關［11］，因此檢測胸腺淋巴細胞Fas的變異對于探討MG的發(fā)病機制具有重要意義。

血清中少許sFas主要為Fas mRNA以不同方式進行剪接加工后的翻譯產(chǎn)物，明顯升高則多為Fas基因突變導致Fas mRNA表達異常。缺乏跨膜區(qū)的sFas易從自身反應性T細胞膜上脫落，使其喪失部分與Fasl結合位點，未脫落的sFas又與淋巴細胞膜上的Fas（主要為mFas）競爭性結合Fasl導致Fasl與自身反應性T細胞mFas結合水平下降，下調(diào)自身反應性T細胞凋亡［12］。本研究結果顯示，在Fas蛋白表達上，胸腺瘤合并MG組患者胸腺淋巴細胞Fas明顯減少，表達明顯減弱，而血清中sFas水平明顯高于胸腺瘤不合并MG組，提示MG患者的胸腺淋巴細胞存在Fas mRNA表達異常和Fas基因異常，可能是誘發(fā)MG等自身免疫性疾病的原因。

本研究中對Fas基因進行測序和突變檢測分析顯示，兩組患者胸腺淋巴細胞均有第3、6、7號外顯子堿基置換突變發(fā)生。其中3號外顯子和7號外顯子各有1個突變位點，但不改變所編碼氨基酸的類型，且兩組發(fā)生的概率基本相同，均在15%～25%之間。6號外顯子共發(fā)現(xiàn)有5個突變位點，且均會改變編碼氨基酸的類型。其中3個位點的突變發(fā)生率兩組基本相同，在5%～15%之間。另外2個位點（第16、21位）均為T→G堿基置換突變，所編碼氨基酸分別發(fā)生TTG（Leu）→TGG（Trp）和TGG（Trp）→GGG（Gly）改變，胸腺瘤合并 MG組發(fā)生率分別為65%和75%，明顯高于胸腺瘤不合并MG組（發(fā)生率均為5%）。由于6號外顯子編碼Fas蛋白跨膜區(qū)，其發(fā)生基因突變可能會造成Fas蛋白跨膜區(qū)結構變異或消失，機體出現(xiàn)淋巴細胞表面mFas減少，血清中缺乏跨膜區(qū)的sFas增多現(xiàn)象，與上述實驗結果相互對應。因此，可以推測，MG發(fā)生的根本原因可能是胸腺淋巴細胞Fas基因突變，尤其是外顯子6的某些位點突變而導致的Fas蛋白跨膜區(qū)的缺陷，MG只是Fas基因突變引起的自身免疫性疾病之一，與近年來文獻報導相符［13］。同時也可以對有些胸腺瘤合并MG患者同時還伴有甲亢、單純紅細胞貧血、扁平苔蘚及SLE等多種自身免疫性疾病以及有些患者在切除胸腺瘤數(shù)年后還可出現(xiàn)MG等現(xiàn)象進行解釋。

胸腺瘤和全胸腺擴大切除是目前治療MG的首選方法，有一定療效，但并不理想，尤其是全身型MG，病史較長者，術后仍需長期服藥，癥狀時有反復，其主要原因是血清及胸腺以外的淋巴器官內(nèi)仍有釋放抗乙酰膽堿受體抗體等自身抗體的淋巴細胞沒有被清除，MG治療仍是一個臨床難題。如能在基因水平誘導淋巴細胞凋亡，以抑制抗乙酰膽堿受體抗體等自身抗體的產(chǎn)生，有可能為MG的治療提供有效的對因治療方法。

綜上所述，MG可能是一種包括Fas等自身基因控制的自身免疫性疾病，在基因水平誘導淋巴細胞凋亡，以抑制抗乙酰膽堿受體抗體等自身抗體的產(chǎn)生，有可能為MG的治療提供有效的對因治療方法，有必要在今后的研究工作中進行探索。

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