苑召虎 胡子有 王惠麗 吳炳義

星形膠質(zhì)細(xì)胞（Ast）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中數(shù)量最多的細(xì)胞，約占健康成人CNS細(xì)胞總數(shù)的40%，Ast能合成及分泌多種神經(jīng)活性物質(zhì)，為神經(jīng)元及其他膠質(zhì)細(xì)胞相互作用提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，在維持神經(jīng)元內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定、軸突生長(zhǎng)等方面具有重要作用，與 CNS疾病密切相關(guān)［1－3］。

CNS能對(duì)外界各種刺激作出不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，具有很強(qiáng)的適應(yīng)和恢復(fù)能力。然而，各種CNS損傷，如腦外傷、腦卒中和神經(jīng)退行性疾病等可引起活化的炎性細(xì)胞釋放細(xì)胞因子從而激活ERK1／2信號(hào)通路，將信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖與分化的改變［4］。這些改變促進(jìn)了損傷部位Ast的過度增殖，最終形成膠質(zhì)疤痕，阻礙新生神經(jīng)元軸突的再生及連接，從而影響腦功能恢復(fù)。膠質(zhì)疤痕是神經(jīng)損傷后神經(jīng)元退行性變最重要的影響因素，可視為神經(jīng)損傷后的第三位病變［5－6］。因此，探究 ERK1／2信號(hào)通路在Ast增殖及其細(xì)胞周期調(diào)控中的作用，為膠質(zhì)疤痕的治療尋求一種可能的途徑，具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：1日齡雄性SD乳鼠9只，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.1.2 主要試劑與儀器：小鼠源性膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體（按1∶100體積比例稀釋）購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；小鼠源性GAPDH單克隆抗體（按1∶1000體積比例稀釋）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔源性p－ERK1／2以及ERK1／2多克隆抗體（均按1∶1000體積比例稀釋）購(gòu)自Epitomics公司；羊抗兔及羊抗小鼠IgG IR Dye 800cw二抗（均按1∶15 000體積比例稀釋）購(gòu)自O(shè)dyssey公司；FITC-羊抗小鼠的純化二抗（按1∶100體積比例稀釋）購(gòu)自Jackson公司；U0126，即ERK1／2磷酸化的特異性抑制劑購(gòu)自Enzo Life Science；細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自BD公司；正常山羊血清封閉液購(gòu)自Boster公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；智能激光掃描共聚焦顯微鏡（OLYPMUS FV10i-W），流式細(xì)胞儀（BD LSRFortessa），Western Blot掃膜系統(tǒng)（Odyssey LI-COR）。

1.2 方法

1.2.1 Ast的原代培養(yǎng)及鑒定：取SD鼠3只，無(wú)菌操作下取其大腦組織，體視鏡下分離大腦皮層，剪碎，勻漿，過濾后以4.5×105／mL細(xì)胞密度種于35mm2培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)4周的成熟的Ast［7］，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3次，用4%（質(zhì)量濃度）多聚甲醛室溫下固定40min后用羊血清封閉1h，PBS洗3次之后加入0.5mL 1∶100稀釋的兔源性GFAP一抗，室溫下孵育2h，PBS洗5次后加入0.5mL 1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗小鼠的二抗，室溫下孵育1h，PBS洗3次后，在熒光倒置顯微鏡下觀察Ast的染色狀況以作純度鑒定，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光。200倍熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其與200倍普通光鏡下總細(xì)胞的比值，即細(xì)胞純度［7］。經(jīng)鑒定培養(yǎng)的原代Ast合格（純度≥95%），可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Ast的原代培養(yǎng)及鑒定重復(fù)3次。

1.2.2 兩組觀察指標(biāo)檢測(cè)：將培養(yǎng)成熟的大鼠原代Ast分為U0126組和對(duì)照組兩組。U0126組Ast棄去培養(yǎng)基，加入2mL 含60mmol／L U0126［8］、10% （體 積 分 數(shù)）FBS 的 DMEM，置37℃，5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2孵箱中培養(yǎng)24h；對(duì)照組不加U0126，余處理相同。

（1）Western Blot檢測(cè)兩組ERK1／2磷酸化水平：將上述兩組細(xì)胞用冰PBS洗滌3次，然后用含1%（體積分?jǐn)?shù)）蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，一抗為小鼠源性GAPDH單克隆抗體、兔源性p-ERK1／2多克隆抗體和兔源性ERK1／2多克隆抗體，二抗為羊抗鼠及抗兔IgG IR Dye 800cw二抗，孵育后，將PVDF膜置于Odyssey掃膜系統(tǒng)進(jìn)行掃描，得到有目的蛋白（p－ERK1／2及ERK1／2均為兩條蛋白條帶，相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）分別為42 000、44 000）與內(nèi)參蛋白（GAPAH，Mr為37 000）條帶的 Westren bolt圖片后，將該圖片導(dǎo)入到gel-pro analyzer軟件檢測(cè)目的蛋白條帶和內(nèi)參的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為該組ERK1／2磷酸化水平的相對(duì)表達(dá)量。每次實(shí)驗(yàn)每組檢測(cè)3次。

（2）Click-iT Edu檢測(cè)兩組 Ast增殖情況：將上述兩組細(xì)胞半量換液，加入1mL含20μmol／L EdU、10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS的低糖 DMEM，使EdU終濃度為10μmol／L。將其置于37℃，5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，加入3.7%（體積分?jǐn)?shù)）甲醛1mL，室溫下固定15min，棄去固定液，用3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）BSA洗2次。然后加入 0.5%（體積分?jǐn)?shù)）Triton X-100 1 mL室溫下孵育20min；棄去通透液，用3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）BSA 洗2次。然后加入0.5mL Click-iT 反應(yīng)混合液，室溫下避光振蕩30min，棄去反應(yīng)液，用3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）BSA洗1次。然后再加入1X Hoechst 33342反應(yīng)液1mL室溫下避光反應(yīng)30 min。用PBS清洗2次后，于激光共聚焦顯微鏡下拍照分析并計(jì)算其增殖細(xì)胞百分比，計(jì)算公式為：Ast增殖細(xì)胞百分比＝（增殖的細(xì)胞數(shù)目／總細(xì)胞數(shù)目）×100%。其中細(xì)胞核著紅色熒光的為增殖細(xì)胞，細(xì)胞核著藍(lán)色熒光的為未增殖細(xì)胞。每次實(shí)驗(yàn)每組檢測(cè)3次。

（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞周期Ast百分比：將上述兩組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，PBS洗2遍，用0.25%（質(zhì)量濃度）胰酶消化處理后，收集懸浮細(xì)胞于室溫下以400g離心5min。棄上清，加入250 μL胰酶溶液（A液），用手指輕彈將其混勻，室溫下反應(yīng)10min。然后再加入200μL的胰酶抑制劑和核糖核酸酶的混合液（B液），用手指輕彈將其混勻，室溫下反應(yīng)10min。最后加入200μL冰冷的PI染液（C液）用手指輕彈將其混勻，4℃避光反應(yīng)10min。然后將其在3h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，讀取并記錄兩組細(xì)胞在G1期、S期和G2期的細(xì)胞百分比。每次實(shí)驗(yàn)每組檢測(cè)3次。

（1）～（3）的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間各指標(biāo)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組 ERK1／2磷酸化水平 U0126組ERK1／2的磷酸化水平（39.13%±6.71%）明顯低于對(duì)照組（100%）（t＝15.71，P＜0.01），ERK1／2蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t＝0.153，P＞0.05）（圖1）。

圖 1 兩組ERK1／2磷酸化水平比較（Western blot）

2.2 兩組Ast增殖情況 對(duì)照組增殖細(xì)胞布滿整個(gè)視野，U0126組則增殖細(xì)胞零星可見（圖2）。U0126組 Ast增殖細(xì)胞百分比〔（2.63±1.14）%〕低于對(duì)照組〔（21.43±3.81）%〕（t＝21.13，P＜0.01），約為對(duì)照組的1／7。

圖2 兩組Ast增殖情況：紅色的為Click-iT Edu染色（×200），為增殖細(xì)胞；藍(lán)色的為 Hoechst 33342染色（×200），為未增殖細(xì)胞

2.3 兩組Ast不同細(xì)胞周期增殖情況檢測(cè) G1期 U0126組 Ast〔（93.67±0.68）%〕高于對(duì)照組〔（84.63±1.00）%〕（t＝12.91，P＜0.01）；S 期U0126組 Ast〔（2.90±0.23）%〕低 于 對(duì) 照 組〔（14.21±1.14）%〕（t＝16.87，P＜0.01）；G2期U0126組 Ast〔（3.43±0.88）%〕高 于 對(duì) 照 組〔（2.08±0.21%）%〕（t＝4.35，P＜0.05）。

3 討論

Ast是CNS中最主要的細(xì)胞成分之一，它為CNS功能的發(fā)揮提供了相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。外界各種刺激均可引起Ast過度增殖，最終形成膠質(zhì)疤痕，成為神經(jīng)損傷后神經(jīng)元退行性變最重要的影響因素，嚴(yán)重影響腦功能的恢復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，用ERK1／2磷酸化的特異性抑制劑U0126降低Ast ERK1／2的磷酸化水平后，能明顯降低Ast的增殖細(xì)胞百分比，抑制Ast的增殖；研究中還發(fā)現(xiàn)降低Ast ERK1／2的磷酸化水平可顯著增高G1期和G2期Ast的百分比，同時(shí)降低S期Ast的百分比。

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族是一系列絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，包括Raf（又稱為MAPKKK，即 MAPKK 激酶）、MEK（又稱為MAPKK，即MAPK激酶）及ERK。其中，ERK具有廣泛的生物學(xué)活性，是細(xì)胞外刺激向細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交匯點(diǎn)，可經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子及G蛋白耦聯(lián)受體等途徑激活。當(dāng)細(xì)胞因子與受體結(jié)合后，可依次激活大鼠肉瘤（Ras）蛋白／Raf／ERK［9－10］。細(xì)胞接受細(xì)胞外信號(hào)有效刺激以后，可啟動(dòng)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過多種途徑將信號(hào)傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞周期的調(diào)控中起著重要作用。Krishan等［11］為研究ERK1／2的磷酸化水平對(duì)Ast增殖的影響，用U0126抑制Ast ERK1／2的磷酸化，降低ERK1／2的磷酸化水平后，發(fā)現(xiàn)Ast細(xì)胞核中含胸腺嘧啶脫氧核苷類似物Edu的Ast比例明顯降低，即降低ERK1／2磷酸化水平可明顯抑制Ast增殖，阻斷其DNA合成。

細(xì)胞周期分為G1期、S期、G2期和M期。細(xì)胞周期中有兩個(gè)主要調(diào)控點(diǎn)：一是G1期→S期轉(zhuǎn)折點(diǎn)，即細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)入DNA合成期的調(diào)控點(diǎn)；另一調(diào)控點(diǎn)為G2期→M期的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，即細(xì)胞一分為二的調(diào)控點(diǎn)。本研究中發(fā)現(xiàn)降低Ast ERK1／2的磷酸化水平后，G1期Ast百分比明顯增加，同時(shí)S期Ast百分比降低，提示Ast從G1期向S期的轉(zhuǎn)化被阻斷，即Ast的增殖被阻斷在DNA合成前期（即G1期）；G2期Ast百分比增高，提示Ast從G2期向M期的轉(zhuǎn)化被阻斷，即將Ast的增殖阻斷在G2期，抑制Ast分裂。

細(xì)胞內(nèi)周期因子依賴性激酶（CDK）控制著細(xì)胞周期各時(shí)相之間的順序轉(zhuǎn)換，其活性由周期素（cyclin）激活，此兩者起著正向調(diào)節(jié)的作用。細(xì)胞周期的負(fù)向調(diào)節(jié)因子主要是細(xì)胞內(nèi)周期因子依賴性激酶抑制物，即CDK的抑制物（CDIs）。有研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控因子25A（CDC25A）的下調(diào)可降低細(xì)胞內(nèi)周期因子依賴性激酶2（CDK2）-細(xì)胞周期素E（cyclin E）活性，進(jìn)一步降低活性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白（Rb）的磷酸化水平，從而抑制其細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)化，將其阻斷在 G1期［12－13］。Timofeev等［14］研究發(fā)現(xiàn)CDC25磷酸化水平下調(diào)可降低胞內(nèi)周期因子依賴性激酶1（CDK1）-細(xì)胞周期素B（cyclin B）的活性從而抑制其細(xì)胞周期G2期→M期的轉(zhuǎn)化，將其阻斷在G2期。

既往研究發(fā)現(xiàn)，降低ERK1／2磷酸化水平能通過影響CDC25A／CDK2的磷酸化水平阻斷G1期向S期轉(zhuǎn)化［15］，也可通過降低細(xì)胞周期調(diào)控因子25C（CDC25C）活性可以阻斷G2期向 M期轉(zhuǎn)化［16］，因此推測(cè)降低 Ast ERK1／2的磷酸化水平也可通過影響CDC25A／CDK2和CDC25C這兩條信號(hào)途徑來抑制Ast的增殖，分別將其抑制在G1期和G2期，但具體的信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究探索。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，降低ERK1／2磷酸化水平能明顯抑制Ast增殖，對(duì)膠質(zhì)疤痕的干預(yù)治療提供了初步的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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