丁葵英 高 彥 于金玲 孫 軍 趙 晗 李 凱

（濰坊出入境檢驗檢疫局 山東濰坊 261041）

1 前言

隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程加快，蔬菜中的農(nóng)藥殘留問題已成為當(dāng)今世界關(guān)注的焦點，特別是近年來農(nóng)藥殘留事件時有發(fā)生，許多國家都對多種農(nóng)藥殘留設(shè)定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。咪鮮胺、異菌脲、蟲酰肼和噻螨酮是在蔬菜和水果中經(jīng)常使用的保鮮劑、殺蟲劑和殺螨劑，雖屬于低毒農(nóng)藥，但因使用較廣、殘效期長，對環(huán)境和食品安全具有潛在危險[1-3]；涕滅威及其代謝物涕滅威亞砜和涕滅威砜都是毒性相對較大的農(nóng)藥，對生態(tài)環(huán)境中土壤和水體的污染較大，對人體健康具有不容忽視的危害[4]。這7種農(nóng)藥在出口大蔥、姜、洋蔥、蒜和蒜苔中均是必檢項目。目前蔬菜中這7種農(nóng)藥殘留的單獨或與其他農(nóng)藥殘留一起檢測常見報道，蟲酰肼的測定主要采用紫外檢測高效液相色譜（HPLC）法，而涕滅威及其衍生化合物的檢測主要是柱后衍生-熒光檢測的高效液相色譜法[5]，咪鮮胺、異菌脲和其他物質(zhì)一起測定的液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法也有報道[6-8]，但作為辛辣蔬菜中7種物質(zhì)同時檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法還未見報道。

蔬菜基質(zhì)較復(fù)雜，特別是辛辣蔬菜樣品，富含硫基及多種雜原子，這類化合物一般方法無法驅(qū)除，極易影響結(jié)果的判定及定量[4]。因此，本研究采用凝膠滲透色譜結(jié)合分散固相萃取技術(shù)對樣品進(jìn)行凈化，然后采用HPLC-MS/MS法對辛辣蔬菜中7種農(nóng)藥化合物實現(xiàn)了一針同時分析，12min內(nèi)完成7種化合物的上機檢測。方法凈化效果較好，自動化程度較高，省時，定性、定量準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，結(jié)果滿意。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

甲醇、乙腈、環(huán)己烷：色譜純，美國Fisher公司；乙酸乙酯：色譜純，德國Merk公司；甲酸：色譜純，美國Tedia公司；無水硫酸鎂：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，使用前在500℃馬弗爐內(nèi)烘5h，200℃時取出冷卻備用；中性氧化鋁：上海五四化學(xué)試劑有限公司；石墨炭黑粉（GCB）、C18、PSA粉和氨丙基粉（NH2）：均購于Agela technologies inc公司；噻螨酮、蟲酰肼、異菌脲、涕滅威砜、涕滅威、涕滅威亞砜和咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于≥97%，美國Sigma-Aldrich Laborchemikalien Gmbh 公司或德國Dr.Ehrenstorfer公司。

2.1.2 儀器

Agilent6430液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Agilent公司，配有電噴霧離子源；Accuprep GPC凝膠滲透色譜儀：美國J2公司，配有固定波長264nm紫外檢測器；Bio-Beads SX-3凈化柱：30mm×210 mm，填裝23g填料，介質(zhì)是中性、多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球體，排斥極限為相對分子量400-14000；Agilent ZORBAX SB-C18柱：2.1mm×100mm，1.8μm；Mettler AE163天平：感量為0.1g和0.0001g；5810R冷凍離心機：德國Eppendof公司；氮吹儀：N-eovap111；WD9000微波爐：格蘭仕；渦流混勻器、T25均質(zhì)器：IKA；0.45μm針頭過濾器；GM 200碾磨儀。

2.2 方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取10mg（精確至0.1mg）蟲酰肼、噻螨酮、涕滅威砜、涕滅威亞砜、涕滅威、咪鮮胺和異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于100mL容量瓶中，用乙腈溶解，準(zhǔn)確定容至100mL。標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度100μg/mL，存儲期6個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別移取上述各標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100mL容量瓶，用乙腈準(zhǔn)確定容，得混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。混合標(biāo)準(zhǔn)液中咪鮮胺和蟲酰肼的濃度為1.0μg /mL，噻螨酮、涕滅威砜、涕滅威亞砜、涕滅威和異菌脲的濃度為4.0 μg/mL；同上法，配制各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.0μg/mL的單標(biāo)液。0℃以下避光保存，有效期3個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取混合中間工作液0.025、0.05、0.1、0.5、1和5mL于10mL容量瓶中，用流動相準(zhǔn)確定容，得到混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（現(xiàn)用現(xiàn)配）。其中，蟲酰肼和咪鮮胺的濃度為0.025、0.005、0.01、0.05、0.1和0.5 μg/mL，噻螨酮、涕滅威砜、涕滅威亞砜、涕滅威和異菌脲的濃度為0.01、0.02、0.04、0.2、0.4和2.0μg/mL。

2.2.2 樣品提取

借鑒國內(nèi)外較為嚴(yán)格的制樣方法，根據(jù)不同基質(zhì)采用不同的制樣方法：大蔥和蒜苔切段、洋蔥撕成小碎片、大蒜去皮，低溫下保存待用。實驗時取出部分有代表性的樣品，縮分不少于500g試樣，裝入清潔容器內(nèi)，加封后標(biāo)明標(biāo)記。準(zhǔn)確稱取15.00g（精確到0.01g）樣品，微波消解后，加入3g無水硫酸鎂，然后加入15mL乙腈，于均質(zhì)機上15000r/min高速均質(zhì)2min，10000r/min離心10min。

2.2.3 樣品凈化

準(zhǔn)確移取8m L上述提取液，氮氣吹干，以8.0mL乙酸乙酯+環(huán)已烷（1+1）混合溶液溶解后上凝膠滲透色譜儀。乙酸乙酯+環(huán)已烷（1+1）混合溶液作為流動相，流速4.7 mL/min；樣品進(jìn)樣量5.0 mL；收集6-12 min時流出的組分于100mL旋轉(zhuǎn)瓶中40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干；然后加入2mL乙腈溶解殘渣，過100gPSA和50gNH2粉，渦混1min后靜止；準(zhǔn)確取1mL上清液氮吹，加 1mL初始流動相復(fù)溶，過0.2μm過濾膜，上機測定。

2.2.4 LC-MS/MS條件

2.2.4.1 LC條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：300 μL/min，共運行12min；流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 ESI+電離模式下液相色譜梯度洗脫條件

2.2.4.2 MS/MS條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子(ESI+)模式掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式掃描；毛細(xì)管電壓：電噴霧電壓4500v；干燥器(N2)流速為：10 L/min；溫度：300 ℃。其他參數(shù)見表2。

表2 7種化合物的液相色譜-質(zhì)譜條件

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜和質(zhì)譜條件的選擇

3.1.1 色譜柱的選擇

鑒于分離組分較多，且多種物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，首先選擇色譜柱對目標(biāo)化合物進(jìn)行有效分離。對比了Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm×100mm，1.8μm)（柱1）、Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm×50mm，1.8μm)（柱2）和Waters A CQUITY BEH C18(2.1 mm×100mm，1.7μm)（柱3）3種柱的分離效果。結(jié)果表明：柱1和柱3優(yōu)于柱2，長柱分離效果遠(yuǎn)高于短柱，特別是對于咪鮮胺、異菌脲和蟲酰肼 3種化合物，長柱能明顯分離，而短柱則不能有效分離，這是由于在柱填料粒徑相同的情況下，柱子越長，分離效果越好。在粒徑相近的情況下，柱1與質(zhì)譜儀結(jié)合能達(dá)到更高的靈敏度，因此選擇柱1作為本研究的分離柱。

3.1.2 質(zhì)譜條件的選擇

3.1.2.1 母離子的選擇

將各農(nóng)藥配成濃度為1.0μg/mL的單標(biāo)，根據(jù)各化合物分子的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)電離性質(zhì)，分別選用電噴霧（ESI+）離子源，通過直接進(jìn)樣法，在優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)的基礎(chǔ)上，對各化合物進(jìn)行母離子全掃描，獲得靈敏度較高的涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、蟲酰肼、噻螨酮、撲海因和咪鮮胺的M+H的離子分別為213.1、223.2、207.0、353.1、353.0、330.0和378.0。

3.1.2.2 其他質(zhì)譜參數(shù)的選擇

在確定各種農(nóng)藥的母離子后，參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用子離子掃描方式對子離子及碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化選擇。隨著碰撞能量的不斷增加，選擇能產(chǎn)生最高豐度子離子的碰撞能量作為CID最佳碰撞電壓。離子源溫度：300℃；載氣溫度：300℃；載氣流量：8L/min；噴霧壓力：30psi；毛細(xì)管電壓：4000V；光電倍增器電壓增值：400v；掃面范圍：50-400；檢測方式：MRM。

7種農(nóng)藥殘留的其他質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。7中農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖見圖1，圖中1、2、3、4、5、6和7分別為涕滅威亞砜、涕滅威砜、涕滅威、咪鮮胺、異菌脲、蟲酰肼和噻螨酮的色譜峰。

圖1 7種農(nóng)藥總離子流色譜圖

3.2 提取溶劑的選擇

提取試劑的選擇與待測農(nóng)藥的性質(zhì)、檢測方法及樣品的種類和性質(zhì)形態(tài)有很大關(guān)系。依據(jù)相似相溶原理，從試樣種類、待測農(nóng)藥特性和提取溶劑性質(zhì)3方面綜合考慮，以確定選用提取溶劑的原則。本研究的基質(zhì)為辛辣蔬菜樣品，大多屬高水分含量樣品基質(zhì)，這決定本研究需采用中等極性和極性較強的有機溶劑提取。分別選用乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑，在同一添加水平，相同實驗條件下，對所選樣品進(jìn)行回收率實驗。實驗結(jié)果表明：乙腈對所有成分的回收率都較好，而乙酸乙酯對涕滅威、蟲酰肼、咪鮮胺的回收率遠(yuǎn)不及乙腈高。綜合考慮各方面原因，最終選擇純乙腈作為提取溶劑。

3.3 凈化方法的建立

3.3.1 凝膠滲透色譜凈化方法的建立

本研究目標(biāo)化合物在264nm（凝膠滲透色譜儀自帶固定波長紫外檢測器）皆有紫外吸收，分子量在200-400之間，其中分子量最小為涕滅威亞砜207和最大咪鮮胺378，所以選擇咪鮮胺的出峰時間為開始收集時間，涕滅威亞砜出峰結(jié)束的時間為收集結(jié)束的時間，此時間段可將所有目標(biāo)化合物收集。為保證收集時間的準(zhǔn)確性，將10mg/mL農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品8mL吹干后，用8mLGPC流動相（乙酸乙酯：環(huán)己烷體積比1:1）復(fù)溶，過GPC，其皆在6min之后開始有紫外吸收，而在14min已沒有紫外吸收，故確定6-14min為收集時間。

3.3.2 凝膠滲透色譜凈化效果的研究

為考察凝膠滲透色譜的凈化效果，選定m/z在200-1000之間范圍內(nèi)蒜苔提取液進(jìn)行離子全掃描，全掃描的質(zhì)譜參數(shù)見表2，GPC凈化前后的全掃描圖分別見圖2和圖3。由圖2、圖3可看出m/z為 722.55、743.63、764.06、864.74、1043.77、1069.13、1152.99、1224.32的等主要雜質(zhì)峰過GPC后幾乎被完全去除掉。

圖2 GPC凈化前蒜苔提取液的全掃描圖

圖3 GPC凈化后蒜苔提取液的全掃描圖

3.3.3 QuEChERS技術(shù)對樣品凈化的研究

目前分散固相萃取常用的吸附劑主要有C18、NH2、GCB和PSA等幾種，PSA粉可在一定程度上除去基質(zhì)中的極性干擾物有機酸、糖以及某些極性較強的色素；C18和GCB除維生素、色素、甾醇的能力較好，NH2粉的離子交換能力較PSA弱，可根據(jù)需要選用[9]。為考察吸附劑吸附效果，將2 mL一定濃度乙腈溶解的農(nóng)藥混標(biāo)溶液分別加入50、100和150 mg不同的吸附劑，經(jīng)振蕩、離心后，取上清液1mL，氮吹，流動相定容，過0.2μm濾膜上機，計算回收率來考察吸附劑對農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)吸附情況，數(shù)據(jù)見表3。

表3 不同吸附劑處理后7種農(nóng)藥的回收率

由表3可知： C18和GCB對4種標(biāo)準(zhǔn)品有比較明顯的吸附，而NH2粉對噻螨酮有明顯的吸附，PSA對所有標(biāo)準(zhǔn)品都沒有明顯吸附。由于在樣品提取液中目標(biāo)物與雜質(zhì)共存，并且雜質(zhì)的含量要遠(yuǎn)高于目標(biāo)物，在加入吸附劑后，吸附就存在著一定的優(yōu)先和選擇性，因此在實際樣品檢測中，吸附劑對目標(biāo)物的吸附與在純乙腈體系應(yīng)有所不同，甚至相差較大。為證明此問題，以蒜苔為基質(zhì)，乙腈提取，配制撲海因、咪鮮胺、蟲酰肼和噻螨酮、涕滅威的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，過PSA和NH2粉，考察其回收率。由表4可看出，加入樣品基質(zhì)后，粉末對標(biāo)準(zhǔn)品的吸附大大減少，其回收率大大增高，所以本研究選擇50mgPSA和100mgNH2粉作為凈化吸附劑。

表4 不同吸附劑處理后4種農(nóng)藥的回收率

3.3.4 吸附劑凈化效果的研究

根據(jù)分散固相萃取的原理是通過吸附粉末的吸附作用達(dá)到凈化的效果，此種凈化方法主要去除的是極性中小分子。圖4和圖5分別是蒜苔樣品經(jīng)凝膠滲透色譜凈化后，PSA和NH2粉吸附凈化前后的全掃描圖，從兩圖的比較可以看出，吸附劑對雜質(zhì)有著非常強烈的吸附作用，過粉后圖中主要的小分子雜質(zhì)峰大大降低。

圖4 粉末吸附凈化前的蒜苔樣品全掃描圖

圖5 粉末吸附凈化后的蒜苔樣品全掃描圖

3.4 校正曲線、線性范圍和定量限

將2.2.1節(jié)中工作液配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液按2.2.4的LC-MS/MS的色譜條件上機測定。各種農(nóng)藥定量離子5次測定的平均峰面積y對質(zhì)量濃度x（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍，結(jié)果見表5。從表5數(shù)據(jù)可看出，r2均大于0.99，表明在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)7種農(nóng)藥的線性關(guān)系均良好，且可以較好的克服樣品提取、凈化及上機測定過程造成的誤差。

用蒜苔空白樣品作為基質(zhì)添加不同量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品后按“2.2.2和2.2.3”節(jié)所述方法處理后測定，定量限（LOQ）根據(jù)10倍信噪比，檢測限（LOD）根據(jù)3倍信噪比計算得出，結(jié)果見表5。由表5可知，該方法的LOQ均低于日本、歐盟等發(fā)達(dá)國家規(guī)定的目標(biāo)農(nóng)藥殘留限量（MRL），能滿足日常檢測的需求。

表5 種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限

3.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在陰性蒜苔、大蔥、洋蔥和大蒜樣品中的定量限添加水平下，按上述提取、凈化和檢測步驟，做15個平行性實驗，計算各種農(nóng)藥的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以考察不同基質(zhì)中方法的準(zhǔn)確度和精密度，其平均回收率均在70-110%之間，RSD均小于5%，說明運用本研究建立方法得到的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確可靠。

此外，對本地市場銷售和各公司報檢的大蔥、蒜苔、大蒜和洋蔥抽取20份樣品進(jìn)行檢測，檢出涕滅威亞砜和咪鮮胺4份，并且在這4份樣品中，涕滅威亞砜和咪鮮胺的檢出值皆在其線性濃度范圍之間。

4 結(jié)論

本研究建立了辛辣蔬菜中常見7種農(nóng)藥的凝膠滲透色譜結(jié)合分散固相萃取法凈化，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測的方法。其中GPC凈化除去蔬菜中大部分大分子雜質(zhì)，達(dá)到將雜質(zhì)和目標(biāo)組分分離的目的；分散固相萃取法作進(jìn)一步凈化，混合PSA和NH2粉可很好的吸附蔬菜中的色素、有機酸等小分子化合物。該方法具有靈敏度高、自動化程度高、重現(xiàn)性好、凈化效果好等特點，適合多組分農(nóng)藥殘留的定量檢測與定性確證，能夠滿足包括歐盟、日本等國家和地區(qū)對于蔬菜中農(nóng)藥殘留限量的要求。

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