杜利君 姚亞婷 王靜慧 劉曉琳 吳雅欣

(山西出入境檢驗(yàn)檢疫局 山西太原 030024)

1 前言

原花青素(procyanidins)，是一類由不同數(shù)量的單體黃烷-3-醇縮合而成的聚多酚類物質(zhì)，為植物多酚天然抗氧化劑，由于在酸性介質(zhì)中加熱可產(chǎn)生相應(yīng)的花青素，因此稱為原花青素。最簡單的原花青素是兒茶素、表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體。此外，還有三聚體、四聚體等直至十聚體。按聚合度的大小，通常將二一四聚體稱為低聚體(Procyanidolic Oligomers，簡稱OPC)，將五聚體以上的稱為高聚體(Procyanidolic Polymers，簡稱PPC)[1]。其廣泛存在于各種水果如葡萄、蘋果和山楂的皮、核、梗以及黑荊樹、馬尾松、思茅松和落葉松等植物中。研究表明[2]，原花青素是一種強(qiáng)抗氧化劑和強(qiáng)自由基清除劑，在人體內(nèi)的抗氧化和清除自由基[3]的能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍[4],具有保護(hù)心血管、預(yù)防高血壓、抗腫瘤[5]、抗輻射、抗疲勞、抗突變及美容等作用,并且能夠增強(qiáng)視力、提高夜視能力、消除眼睛疲勞,是一種應(yīng)用前景十分廣闊的植物功能成分。因而在醫(yī)藥、保健和食品等領(lǐng)域具有廣泛的用途。因此對于原花青素含量的檢測是目前面臨的一個(gè)難題。

目前對于原花青素的檢測的常用方法有可見分光光度法、高效液相色譜法[6]、電化學(xué)法[7]、流動注射化學(xué)發(fā)光法[8]、原子吸收法[9]、紫外分光光度法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[12]。目前應(yīng)用最普遍的是可見分光光度法，它又分為香草醛一鹽酸法[13]、正丁醇-鹽酸法[14]、鐵鹽催化比色法[15]、KMnO4法[16]。鐵鹽催化比色法規(guī)定為保健食品中原花青素的檢測方法，但此方法樣品處理過程需要沸水浴回流40min，操作復(fù)雜，而且平行性不易控制。本研究基于此方法，對沸水浴回流步驟進(jìn)行了改進(jìn)，采用在頂空瓶中密封加熱反應(yīng)，極大地簡化了樣品前處理過程，同時(shí)避免了回流控制不當(dāng)時(shí)，溶液損失以及空氣中氧氣對花青素造成破壞的問題，提高了測定的準(zhǔn)確度和分析速度。已成功用于保健品中原花青素含量的準(zhǔn)確測定。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

紫外可見分光光度計(jì)：德國耶拿公司；電子天平：瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；烘箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；20mL頂空瓶。

2.1.2 試劑

正丁醇、鹽酸、硫酸鐵銨：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇：色譜純，博納艾杰爾科技；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品。

硫酸鐵銨NH4Fe(S04)2?12H20溶液：用濃度為2mol/L鹽酸配成2%(m/v)的溶液；正丁醇鹽酸溶液：將正丁醇與鹽酸按95：5的體積比混合。

2.2 方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，甲醇溶解定容至10mL。此溶液濃度為1mg/mL。精密吸取0、0.1、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配成濃度為0、10、25、50、100、150、200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按2.2.3測定。

2.2.2 樣品提取

粉狀試樣稱取50mg試樣置于100m L容量瓶中，加入30 mL甲醇，超聲處理20 min，放冷至室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，離心或放置至澄清后取上清液待測。

2.2.3 測定

取6 mL正丁醇鹽酸溶液置于20mL頂空瓶中，再加入0.2 mL硫酸鐵銨溶液和1 mL待測溶液，加蓋密封，混勻，置100℃烘箱中，加熱40min，然后立即置冰水中冷卻，在加熱完畢15 min后，于546 nm波長處測吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中原花青素的含量。顯色在1h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 測定原理

原花青素在酸性條件下加熱可發(fā)生一種氧化還原反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色的花青素，而花青素與硫酸鐵銨反應(yīng)可生成較深顏色的化合物，該化合物在550mm處有最大吸收峰，而Fe3+在整個(gè)反應(yīng)體系中則起到一個(gè)催化的作用，且其含量達(dá)到一定水平時(shí)，反應(yīng)才能夠完全，比色測定其吸光值與原花青素標(biāo)準(zhǔn)品對照便可定量計(jì)算樣品中原花青素含量。

3.2 方法的改進(jìn)

原方法為取出6mL正丁醇鹽酸溶液置于具塞錐瓶中，再加入0.2mL 硫酸鐵銨溶液和1mL試樣溶液，混勻，置沸水浴回流，加熱40 min后，測定。所采用的是沸水浴回流來使花青素與硫酸鐵銨反應(yīng)，在實(shí)際操作過程中做大量樣品檢測時(shí)，沸水浴回流步驟復(fù)雜，對儀器和人員要求較高，回流過程控制不當(dāng)，容易使溶液揮發(fā)導(dǎo)致平行性差，而且整個(gè)回流過程中空氣中的氧氣影響花青素的反應(yīng)，從而穩(wěn)定性也差，要想取得一個(gè)好的檢測結(jié)果，對人員、設(shè)施的要求較高。

本方法針對此問題進(jìn)行了研究改進(jìn)，將沸水浴回流改為了頂空瓶密封后在100℃烘箱中保溫40 min，大大減化了操作步驟，提高了大批量檢測任務(wù)的工作效率，同時(shí)反應(yīng)過程隔絕了空氣，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3.3 檢測波長的確定

原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液按2.2.3顯色后，在400-1000可見光波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測定光譜掃描圖見圖1，結(jié)果標(biāo)明，在546nm處有最大吸收。

圖1 原花青素光譜掃描曲線

3.3 線性范圍

分別配成濃度為0、10、25、50、100、150、200 μg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，顯色后測定其吸光度，以“吸光度”為橫坐標(biāo)，以“待測液中原花青素含量”為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.0506+0.0033*X，相關(guān)系數(shù)r為0.997。表明原花青素含量在0-200μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.4 方法的回收率及精密度

選取市場上銷售的潤通美康膠囊作為樣品基質(zhì)，采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加法，進(jìn)行了1、2、5 g/kg 3個(gè)濃度水平的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度水平做10個(gè)平行樣品，方法的精密度及回收率數(shù)據(jù)見表1。

表1 保健品中原花青素測定的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10）

3.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

對潤通美康膠囊保健品分別按照本方法和《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中的方法進(jìn)行檢測，每個(gè)方法測定3次，結(jié)果如表2。

表2 兩種檢測方法的對此

從表2可以看出兩種方法沒有顯著性差異，都滿足方法要求，但本方法改進(jìn)后結(jié)果稍高，可能原因是由于采用頂空瓶密封，隔絕了反應(yīng)過程中的空氣對花青素的氧化導(dǎo)致，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

4 結(jié)論

本方法采用頂空瓶加熱法代替沸水浴回流，檢測保健品中原花青素含量。該方法極大地簡化了檢測步驟，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，方便實(shí)現(xiàn)大批量樣品的檢測，為保健品的質(zhì)量保證提供了一個(gè)簡便有效的檢測手段。

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