曹 軍 于伯華 沈山江 秦志軍

（鹽城出入境檢驗檢疫局 江蘇鹽城 224002）

1 前言

砷(As)是很早就被人類所熟知的金屬元素，在環(huán)境中普遍存在。砷及其化合物在農(nóng)業(yè)上常用作殺蟲、毒鼠和滅釘螺；工業(yè)生產(chǎn)中用于毛皮的消毒、 防腐、脫毛；玻璃工業(yè)中用作脫色劑，同時一些砷化物具有藥用作用。隨著工業(yè)化程度的日趨加快，砷的污染日益加劇，對人類的威脅日趨嚴重。其污染主要來自飲用水、食物中的農(nóng)藥獸藥殘留和燃燒高砷煤等。砷的中毒機理主要被認為是其封鎖了蛋白質(zhì)的氫硫基，或置換了酶活性中心的銅或鋅[1]，砷中毒可引起所謂的黑腳病，嚴重的可以導致癌癥。

元素的毒性大小不僅與其總量有關(guān)，重要的是與元素存在的化學形態(tài)密切相關(guān)。As以多種形態(tài)存在，包括高毒性的As(III)、As(V)，低毒性的MMA(一甲基砷)、DMA(二甲基砷)和基本無毒的TMA(三甲基砷)、AsB(砷甜菜堿)、AsC(砷膽堿)和AsS(砷糖)。研究表明無機砷化合物的毒性遠遠大于甲基砷化合物，而一般認為砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)和砷糖無毒[2]。

我國食品衛(wèi)生標準中規(guī)定了相關(guān)食品的總砷含量，并制定了配套的檢測方法；同時制定了貝類、蝦蟹類及其他水產(chǎn)品(鮮重)中無機砷的限量:≤0.50mg/kg(GB2733-2005)，貝類、蝦蟹類及其他水產(chǎn)品(干重)中無機砷的限量：0.10mg/kg(GB10144-2005)。 其配套的無機砷檢測方法采用6mol/L鹽酸溶液提取樣品中無機砷，采用原子熒光法測定，但對某些樣品的測定產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。進一步研究表明，海產(chǎn)品中含有大量的無毒砷甜菜堿、砷糖，在酸性條件下提取可能發(fā)生分解，轉(zhuǎn)化為無機砷檢出。因此通過測定海產(chǎn)品中總砷或采用酸提法測定無機砷已不能準確反映此類食品中砷的污染狀況，必須進行砷形態(tài)分析，為保障食品安全提供有效數(shù)據(jù)。

目前用于形態(tài)砷分析的技術(shù)主要采用聯(lián)用技術(shù)，其中高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法(HGAFS)，因其成本低，分析靈敏度高，目前已成為一種有效的聯(lián)用檢測方法，用于檢測不同形態(tài)砷含量。由于各類食品的基質(zhì)差異大，樣品提取的條件不同，本文針對水產(chǎn)品和環(huán)境介質(zhì)底泥，采用液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法連用技術(shù)建立相應的形態(tài)砷分析方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

SA-10原子熒光形態(tài)分析儀：北京吉天儀器有限公司。渦旋儀：IKAMS-MiniShaker；超聲波清洗儀：上海科導SK 3300LHC；低速離心機：飛鴿TDL-40B；水浴振蕩器：上海躍進SHZ-A；p H計：梅特勒DELTA320；攪拌碎肉機。

2.1.2 試劑

砷標準品：德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇：均為色譜級，美國Fisher Scientific公司；磷酸氫二銨、鹽酸、硼氫化鉀、雙氧水均為優(yōu)級純；水為去離子水。

2.2 方法

2.2.1 標準溶液的配制

分別準確稱取0.01g（精確至0.0001g）五價砷、一甲基砷、二甲基砷、三價砷標準品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，配制成濃度為100mg/L的標準貯備液，于-4℃保存。按照需要吸取相應標準儲備液，用流動相逐級稀釋成含三價砷、一甲基砷、二甲基砷、五價砷的濃度為20、40、60、80、100g/L的標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.2 儀器條件

2.2.2.1 液相色譜條件

色譜柱:Hamilton PRP-X100陰離子交換分析柱(250mm×4.1mmi.d.,10μm)；Hamilton PRP-X100保護柱(25mm×2.3mmi.d.,12-20μm)；流動相:15mmol/L(NH4)2HPO4，p H6.0；流速:1.0mL/min；進樣體積:100μL。

2.2.2.2 原子熒光條件

光電倍增管負高壓：270V；砷燈總電流：70mA；載氣流量：300mL/min；屏蔽氣流量：500mL/min；流動相流速：1mL/min；蠕動泵轉(zhuǎn)速：80轉(zhuǎn)/min。

2.2.2.3 氫化物發(fā)生條件

載流:7%HCl;硼氫化鉀溶液:1.5%KBH4+0.5%KOH

2.2.3 樣品處理

準確稱取1.0g水產(chǎn)品樣或底泥樣（干樣經(jīng)粉碎機粉碎后，避光密閉保存，濕樣勻漿后冷凍干燥處理，于研缽中研磨，避光密閉保存）于10mL具塞刻度試管中，加入1.2mol/LHCl溶液4mL，混勻，在70℃水浴下恒溫震搖1h，使樣品被充分浸提。取出冷卻，加20%雙氧水4mL，再在70℃水浴下振搖1h。取出冷卻，取2mL樣品溶液（動物源性產(chǎn)品需用0.5mL正己烷脫脂），再加入2mL水搖勻后將所得溶液在3200rpm轉(zhuǎn)速下離心20min，上清液用0.45μm濾膜過濾后上原子熒光形態(tài)分析儀測量。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜分離條件的選擇

在離子交換色譜分離中，廣泛使用磷酸、檸檬酸、硼酸和甲酸的鈉鹽、鉀鹽和銨鹽，它們與其相應的酸或其他酸相混合，用作緩沖液[3]。經(jīng)實驗中選擇15mmol/L(NH4)2HPO4，p H6.0。本實驗采用50ng/mL的砷形態(tài)混標溶液，分別進行分離效果實驗：用10、15、20mmol/L(NH4)2HPO4，以及p H4.0、p H6.0、p H10.0三種不同p H值，試驗結(jié)果表明流動相為15mmol/L(NH4)2HPO4，p H6.0保證了較好的分離效果和適宜的分離時間，見圖1。

圖1 砷的特征譜圖

3.2 氫化物發(fā)生條件的選擇

砷在酸性條件下與硼氫化鉀溶液反應生成砷化氫，該反應是氫化物發(fā)生方法的基礎，因此鹽酸濃度、硼氫化鉀濃度及氫氧化鉀的濃度是影響各組分響應的關(guān)鍵因素，本實驗針對此分別進行了實驗。

3.2.1 鹽酸濃度的影響

配制3%、5%、7%、10%、15%不同濃度的鹽酸溶液，用50μg/L的砷形態(tài)混標溶液進樣，采用歸一化法考察不同濃度的鹽酸對各組分的響應的影響，結(jié)果見圖2。由圖可見，當鹽酸濃度為7%時，各組分響應值的最佳。

圖2 不同濃度鹽酸對砷化氫產(chǎn)生的影響

3.2.2 硼氫化鉀濃度的影響

配制0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%不同濃度硼氫化鉀溶液，用50μg/L的砷形態(tài)混標溶液進樣，采用歸一化法考察不同濃度的硼氫化鉀對各組分的響應的影響，結(jié)果見圖3。由圖可見，當硼氫化鉀濃度為1.5%時，各組分響應值的最佳。

圖3 不同濃度硼氫化鉀對砷化氫產(chǎn)生的影響

3.2.3 氫氧化鉀濃度的影響

配制0.125%、0.25%、0.5%、0.75%、1%不同濃度氫氧化鉀溶液，用50μg/L的砷形態(tài)混標溶液進樣，采用歸一化法考察不同濃度的氫氧化鉀對各組分的響應的影響，結(jié)果見圖4。由圖可見，當氫氧化鉀濃度為0.5%時，各組分響應值的最佳。

圖4 不同濃度氫氧化鉀對砷化氫產(chǎn)生的影響

3.3 提取溶劑提取劑

實驗中常用的3種強酸是鹽酸(HCl)、硝酸(HNO3)和硫酸(H2SO4)[4-6]，由于H2SO4的氧化性很強，并具有脫水性，易引起樣品炭化；硝酸(HNO3)中的NO3-在陰離子柱上保留極強，對柱效影響遠大于Cl-，因此選用HCl做提取劑。稱取一定量的紫菜樣品，采用不同濃度的HCl提取（見表1），從提取率和提取液中砷形態(tài)的變化可得，當HCl濃度為1.2mol/L時，海帶的砷提取率均大于90.0%以上，所以采用1.2mol/L的HCl可以達到較理想的提取效果。

表1 紫菜樣品在不同酸濃度下的砷提取率

3.4 線性范圍與檢出限

配制濃度為20、40、60、80、100g/L的混合標準溶液。以質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標作圖可得一直線，經(jīng)最小二乘法計算，得各形態(tài)砷的回歸方程見表2，在上述條件下，以儀器S/N=3計算，三價砷、一甲基砷、二甲基砷、五價砷的儀器最低檢出限分別為0.3、0.9、1.2、7.9μg/L。

表2 不同形態(tài)砷的線性回歸方程

3.5 加標回收率和精密度試驗

在陰性鮰魚、紫菜及底泥中添加砷的混合標準溶液，添加水平為20μg/kg，按本方法每個添加水平平行測定4次，計算其回收率和相對標準偏差(RSD)。如表3所示，平均回收率為89.99%-97.00%，變異系數(shù)為2.05%-4.42%。說明方法的準確度和精密度均達到殘留分析要求。

表3 添加回收率及精密度試驗 ( n = 4)

4 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜串聯(lián)原子熒光光度法測定水產(chǎn)品及其產(chǎn)地環(huán)境中中4種形態(tài)砷的檢測方法。通過對砷提取率、加標回收率和砷形態(tài)的轉(zhuǎn)化試驗的研究，優(yōu)化了水產(chǎn)品及產(chǎn)地環(huán)境底泥中砷提取劑及其濃度、儀器條件等，該方法前處理簡單、回收率穩(wěn)定、靈敏、準確，雜質(zhì)干擾少，適用于水產(chǎn)品及產(chǎn)地環(huán)境底泥中砷的形態(tài)留量的分析。

［1］ 無機化學叢書編寫組.無機化學叢書[M].北京: 科學出版社,1984.

［2］Kaise T, Fukui S.The chemical form and acute toxicity of arsenic compounds in marine organisms[J].App.Organomet Chem,1992,6:155-160.

［3］ 曹惠君, 李敏, 徐浩.食品中砷形態(tài)分析方法的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2010, 20(3): 500-505.

［4］ 尚德榮, 寧勁松, 趙艷芳, 等.高效液相色譜 氫化物發(fā)生原子熒光(HPLC-HG-AFS)聯(lián)用技術(shù)檢測海藻食品中無機砷[J].水產(chǎn)學報，2010，34（1）：135-138.

［5］Mato-Fernández M J, Ote ro-Rey J R, M oreda-Piňeiro J, et al.A rsenic extraction in m arine biological materials using pressurised liquid extraction[J].Talanta,2007,71:515-520.

［6］ 韋璐, 張宏志, 隋濤, 等.流動注射—氫化物發(fā)生原子吸收光譜法測定蜂膠樣品中的砷和汞[J].檢驗檢疫學刊, 2001, 11(03):18-26.