李 達(dá) 張 琦 蔡 璇 田 雨 鄭錫波 戶慶云

（1.肇慶出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東肇慶 526060；2.琿春出入境檢驗(yàn)檢疫局）

1 前言

桂油是用水蒸氣蒸餾法，從植物的地上部分（新鮮或半干的葉和莖）中取得的精油，其中香氣成分主要由各種揮發(fā)性和半揮發(fā)性的物質(zhì)組成。它是辨別桂油品質(zhì)的一個重要特征參數(shù)。目前，國內(nèi)外對桂油香氣成分的分析還未見報道，因此需要建立一種快速有效的方法對其中的香氣成分進(jìn)行定性分析。

固相微萃取(Solid-Phase Microextraction，SPME)是在固相萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新的樣品預(yù)處理技術(shù)。自1990年加拿大的Pawliszyn教授提出固相微萃取技術(shù)以來，眾多分析工作者對其進(jìn)行研究，使該技術(shù)得到進(jìn)一步的發(fā)展及廣泛應(yīng)用[1-3]。目前, 由于頂空固相微萃取技術(shù)集取樣、萃取及富集于一體，操作簡便，而且具有萃取速度快、操作成本低以及便于實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于谷物、酒類、水果等食品香氣的分析研究中[4-8]。國內(nèi)還未見頂空固相微萃取檢測桂油香氣成分的研究，因此本試驗(yàn)選用肇慶地區(qū)出口的桂油，運(yùn)用頂空固相微萃取方法吸附其揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析香氣成分組成和量比關(guān)系，對于桂油的品質(zhì)鑒定具有重要的意義。

2 材料與方法

2.1 材料

Agilent 7890A氣相色譜儀：配置 5975C MSD檢測器，美國Agilent公司；色譜柱：HP-5MS柱，30×0.25mm×0.25 μm；CTC液體-頂空-固相微萃取三合一自動進(jìn)樣器：瑞士CTC公司；Supelco SPME裝置：美國Supelco公司，包括85 μm 聚丙烯涂層纖維（PA，極性）、100μm 聚二甲基硅烷涂層纖維（PDMS，非極性）、50μm 二乙烯基苯-碳分子篩-聚二甲基硅氧烷涂層纖維（DVB/CAR/PDMS，中極性）、75 μm 碳分子篩二甲基硅烷涂層纖維（CAR/PDMS，中極性）。

2.2 方法

2.2.1 頂空固相微萃取

75 um碳分子篩二甲基硅烷（CAR/PDMS）涂層的萃取頭在首次使用時要進(jìn)行老化，參照廠家提供的資料，將萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化，老化溫度為300℃，載氣流量為0.5mL/min，老化時間1h。固相微萃取借助于CTC自動進(jìn)樣器完成。準(zhǔn)確移取5.00mL混勻的桂油樣品于20mL規(guī)格的頂空進(jìn)樣瓶中，旋緊瓶蓋備用。自動進(jìn)樣器將樣品瓶移動到恒溫加熱器中以500r/min的速度攪拌并在40℃下預(yù)熱20min，插入萃取頭，在相同攪拌速度和加熱溫度下萃取30min后，萃取頭進(jìn)入GC的進(jìn)樣口在250℃下解析100s。

2.2.2 儀器工作條件

氣相色譜條件：柱溫采用程序升溫，起始溫度為60℃，1℃/min升至150℃，保持1min，然后以2℃/min升至250℃，保持10min。進(jìn)樣口溫度為250℃；分流比20:1；載氣為高純He（99.999%），流速為0.5mL/min。

質(zhì)譜條件：EI離子源溫度為230℃，電子能量為70eV，四級桿溫度為150℃；接口溫度為280℃；m/z 50-550。

3 結(jié)果與討論

3.1 萃取纖維涂層的選擇

萃取纖維頭的選擇對待測物質(zhì)固相微萃取具有重要影響。在其他條件恒定下，本實(shí)驗(yàn)比較了85 um 聚丙烯涂層纖維（PA，極性）、100μm 聚二甲基硅烷涂層纖維（ PDMS，非極性）、50μm二乙烯基苯-碳分子篩-聚二甲基硅氧烷涂層纖維（DVB/CAR/PDMS，中極性）、75 μm 碳分子篩二甲基硅烷涂層纖維（CAR/PDMS，中極性）4種不同涂層的纖維頭對桂油中的香氣成分的的萃取效果。以色譜峰個數(shù)和總峰面積作為指標(biāo)來選擇。從表1結(jié)果可以看出，85 μm PA和100μm PDMS萃取頭出峰數(shù)較少且總峰面積較小，50μm DVB/CAR/PDMS和75 μm CAR/PDMS萃取頭分離吸附出的化合物數(shù)量差異較小，但75 μm CAR/PDMS萃取頭的總峰面積較高，分離效果也較好。因此選用75 μm CAR/PDMS萃取頭分離樣品，各種香氣成分的峰型較好且大多數(shù)物質(zhì)得到完全分離。SPME在首次分析前要作空白萃取頭試驗(yàn)，排除萃取頭和儀器的干擾。萃取頭第一次使用前，應(yīng)該插入氣相色譜進(jìn)樣口中解析，以確保涂層本身不帶入污染物或干擾組分。當(dāng)分析完含一定量高分子化合物的樣品后，也要重復(fù)上述的操作以防止對下一次分析造成污染[9]。上述4種纖維涂層的萃取頭使用條件見表2。

表1 不同纖維涂層對桂油萃取效率的影響

表2 不同纖維涂層的使用條件

3.2 樣品量的選擇

為了保證一次SPME萃取量近似于樣品中被測物總量，需對取樣量進(jìn)行考察，以避免萃取纖維吸附出現(xiàn)飽和情況。分別吸取3mL、4mL、5mL、6mL、7mL于20mL頂空萃取樣品瓶中進(jìn)行分析，結(jié)果表明，樣品量在5mL以下SPME為非飽和吸附，見圖1。

3.3 萃取溫度的選擇

萃取溫度增高能增加頂空揮發(fā)性物質(zhì)的濃度，有利于它們的萃取。然而SPME是一個放熱過程，當(dāng)溫度高到一定程度后，化合物的萃取量反而減少[10]。本實(shí)驗(yàn)比較了30℃、40℃、50℃、60℃不同溫度條件下對萃取效果的影響，結(jié)果表明，升高溫度可以增強(qiáng)香氣成分的萃取效果，但當(dāng)溫度超過到40℃時桂油中香氣成分的總峰面積呈下降的趨勢，所以選用40℃作為萃取溫度，見圖2。

圖1 不同樣品量對桂油萃取效率的影響

圖2 不同萃取溫度對桂油萃取效率的影響

3.4 萃取時間與攪拌速度

為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)保持一定的萃取時間。頂空固相微萃取法是一種在平衡狀態(tài)測定被分析物的方法，分析物的平衡狀態(tài)由分析物在系統(tǒng)三相中的物質(zhì)分配決定。這三相包括聚合物薄膜、空氣和基體。在萃取初始階段，分析物很容易且很快富集到石英纖維固定相中，隨著時間的延長，富集速度越來越慢，一旦被分析物在三相中達(dá)到平衡，它們在每一相中的質(zhì)量濃度為一常數(shù)，時間的延長對富集沒有任何意義。所以，要準(zhǔn)確測定分析物在聚合物薄膜中的質(zhì)量濃度，首先要使系統(tǒng)達(dá)到平衡狀態(tài)，該狀態(tài)可通過被分析物的萃取時間與總峰面積測定。本實(shí)驗(yàn)對達(dá)到吸附平衡所需時間作了考察，在20、30、40、50min分析結(jié)果中，30min達(dá)到吸附平衡，因此選擇萃取時間為30min。見表3。增加攪拌速度不僅能加快被萃取物進(jìn)入氣相的速度，還能加強(qiáng)上方氣體的流動，有利于被萃取物在氣體中的傳遞，提高了被分析物的萃取效率。選擇250、500、750r/min作為考察，實(shí)驗(yàn)表明可能本實(shí)驗(yàn)所用樣品量較少，攪拌速度對吸附效率并無顯著性影響。因此，本實(shí)驗(yàn)選取儀器推薦的500r/min最為攪拌速度。

表3 不同萃取時間對桂油萃取效率的影響

3.5 解析時間及樣品預(yù)熱時間

解析過程受進(jìn)樣口溫度，解析時間、待測物性質(zhì)等因素影響，較高的進(jìn)樣口溫度可以縮短解析時間，當(dāng)固相微萃取后在氣相色譜進(jìn)樣口解析時，若解析時間過短就有可能導(dǎo)致解析不完全，會影響下一次的萃取量，出現(xiàn)誤差。本實(shí)驗(yàn)對熱解析溫度為230℃、240℃、250℃、260℃和解析時間30s、50s、100s、150s和200s進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，解析溫度250℃解析時間100s即可達(dá)到充分解析，總峰面積基本不變。對20、30、40和50min預(yù)熱時間的考察結(jié)果表明，樣品預(yù)熱20-40min,樣品的吸附效率達(dá)到一個穩(wěn)定的狀態(tài)，但隨著預(yù)熱時間的延長，香氣成分吸附呈下降趨勢，故選30min適宜。

3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

使用頂空-固相微萃取萃取桂油中的香氣成分，涉及到吸附和解析附的一系列復(fù)雜的物理化學(xué)平衡過程。在此過程中，精確的溫度控制是定量準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵。由于本實(shí)驗(yàn)采用CTC自動進(jìn)樣器，具有精密控溫的加熱裝置。在所有裝有樣品的頂空瓶中溫度嚴(yán)格控制在±0.1℃以內(nèi)，6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變異系數(shù)CV%均小于5%。見表4，表5。

表4 保留時間的重復(fù)性

表5 色譜峰面積的重復(fù)性

3.7 桂油中香氣成分測定結(jié)果與分析

采用本方法檢測桂油中的香氣成分，經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜分析總離子流圖如圖3所示。通過計(jì)算機(jī)NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索和人工解析，共鑒定出41種組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，相對含量占總檢出化合物的97.68%。從表6可以看出，桂油的香氣成分可分為醛類、烯類、酯類等化合物。其中醛類化合物的相對含量約占81%，是桂油香氣中含量最高的物質(zhì)。烯類化合物的相對含量約占10%，這些成分基本代表了桂油香氣成分中的特征香氣物質(zhì)。 桂油有春桂油和秋桂油之分。春桂油，簡稱春油，是清明前后采剝桂皮時修下枝葉所蒸餾的油。含油量較低，鮮枝葉的出油率為0.3%-0.4%。秋桂油，簡稱秋油，乃秋季采摘枝葉所蒸的油。出油率較高，鮮枝葉的出油率為0.4%-0.5%。而春油比秋油的香氣成分略有不同，且春油價格也要貴一些。本實(shí)驗(yàn)分別鑒定春油和秋油的香氣成分得出：春油香氣中的烯類物質(zhì)約占10%、醛類物質(zhì)約占81%；而秋油香氣中的烯類物質(zhì)約為13%、醛類物質(zhì)約占78%。其中桂油中的主成分反式-肉桂醛兩者的相對含量春油比秋油略高，而秋油中的乙酸肉桂酯含量比春油略高，評價桂油的質(zhì)量是以含醛量多少為標(biāo)準(zhǔn)，因此春油質(zhì)量優(yōu)于球油。

圖3 桂油香氣成分GC-MS總離子圖

表6 桂油香氣成分的GC-MS分析結(jié)果

（續(xù)表）

4 小結(jié)

采用頂空-固相微萃取方法測定桂油中的香氣成分，通過優(yōu)化萃取纖維以及實(shí)驗(yàn)條件取得了較好的效果。它克服了傳統(tǒng)樣品處理技術(shù)如：液液萃取、蒸餾萃取、頂空進(jìn)樣、超臨界流體萃取、吹掃-捕集法等需樣品量大、耗時過長、花費(fèi)太高等一些缺陷，不易引起香氣成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化或組成成分的變化，較能準(zhǔn)確的反映出樣品揮發(fā)性組分的組成。本實(shí)驗(yàn)桂油的香氣成分主要為反式-肉桂醛、苯甲醛、順式-肉桂醛、苯乙烯、香豆素、乙酸肉桂酯、水楊醛等。其中反式肉桂醛的相對含量約占70%，為桂油香氣中含量較高的特征化合物。

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