曾 燕 孫 朋 倪學(xué)勤，2* 楊 杰 曾 東，2 張洪瑜，2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，雅安 625014;2.動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

纖維素廣泛分布于自然界，是含量豐富的碳水化合物，占植物界碳含量的1/2以上［1］，而位于植物細(xì)胞壁纖維素之間起抗壓作用的木質(zhì)素卻難以被微生物和酶降解［2］。王占川等［3］研究表明，將秸稈開發(fā)為飼料，使其轉(zhuǎn)化為畜產(chǎn)品將具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。纖維素通過瘤胃菌群發(fā)酵，可作為反芻動物的重要能量來源。反芻動物的瘤胃能同時為好氧、兼性厭氧和絕對厭氧微生物提供良好的棲息環(huán)境(溫度為39～41℃，pH為5.5～7.5)［4］。成年牛瘤胃中棲息的微生物包括200多種細(xì)菌、5個屬的真菌以及原蟲和古菌。瘤胃菌群在數(shù)量上占有絕對優(yōu)勢，在纖維素分解過程中發(fā)揮著重要作用［5］。劉開朗等［6］統(tǒng)計(jì) 2008 年至2009年間在美國奶業(yè)科學(xué)協(xié)會-美國動物科學(xué)學(xué)會(ADSA-ASAS)年會論文集、中國知網(wǎng)、PubMed等數(shù)據(jù)庫中與瘤胃菌群分子多態(tài)性和元基因組學(xué)相關(guān)的文獻(xiàn)有42篇。盡管對瘤胃菌群多樣性和功能的研究取得了一定進(jìn)展，但對其中影響宿主代謝和生產(chǎn)性能的關(guān)鍵功能菌的分離、鑒定、作用模式及其利用的研究仍處于初步階段，許多占優(yōu)勢的菌群至今還未在實(shí)驗(yàn)室里被分離出來。所以，研究瘤胃菌群，尤其是研究分解利用纖維素的菌群具有非常廣闊的前景。

長久以來對反芻動物瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的研究主要采取細(xì)菌分離和培養(yǎng)的方法，不但費(fèi)時費(fèi)力，而且結(jié)果不夠準(zhǔn)確，重復(fù)性差。通過純培養(yǎng)技術(shù)分離的微生物種類僅為11%左右［7］，大部分信息仍處于未知狀態(tài)。自Muyzer等［8］首次將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究以來，復(fù)雜的腸道微生物菌群得到了更加全面準(zhǔn)確的反映。由于反芻動物瘤胃菌群數(shù)量龐大且種類繁多，直接對其進(jìn)行非特異的16SrDNA V3區(qū)DGGE分析，所得到的圖譜通常復(fù)雜且難以分辨。因此，本研究擬將瘤胃內(nèi)容物先進(jìn)行富集培養(yǎng)，而后采用PCRDGGE技術(shù)分析，并對結(jié)果進(jìn)行聚類分析和主成分分析(PCA)，結(jié)合共性和特異性條帶的克隆和測序，評估反芻動物瘤胃菌群在不同培養(yǎng)條件下的多樣性，旨在了解瘤胃細(xì)菌種類，為后續(xù)分離纖維素降解菌時培養(yǎng)條件的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集和處理

瘤胃內(nèi)容物采自四川省雅安市飛機(jī)壩屠宰場。無菌操作采集3份瘤胃內(nèi)容物，每份20～30 g，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和儀器

PCR引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成;2×Taq MasterMix(含染料)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;DGGE成套試劑購自美國Bio-Rad公司;銀染藥品和試劑購自四川瑞進(jìn)特科技有限公司;Gel Extraction Kit購自美國OMEGA公司;pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司;PCR儀為MJ Research PTC-200(美國Bio-Rad公司);DGGE電泳儀為Dcode Universal Detection System［Bio-Rad(加拿大)］;核酸濃度測定儀為 ND-1000 UV-Vis Spectrphotometer(美國NanoDrop公司);凝膠成像系統(tǒng)為GS800 Calibrated Densitometer(美國Bio-Rad公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基

共采用4種培養(yǎng)基，羧甲基纖維素(CMC)培養(yǎng)基［9-10］、蛋白胨纖維素(PCS)培養(yǎng)基［11］、J培養(yǎng)基［12］和K培養(yǎng)基［CMC培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，無羧甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)、微晶纖維素和纖維素粉］。所有培養(yǎng)基121℃滅菌15 min備用。

1.2 富集培養(yǎng)

取3份樣品(編號為A、B、C)，分別稱取1 g瘤胃內(nèi)容物至裝有30 mL培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中。分別在37和50℃靜置培養(yǎng)48 h后搖勻分裝于1.5 mL EP管中，每管1 mL左右，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)菌總DNA的提取

參照文獻(xiàn)［13］提取細(xì)菌總DNA。用核酸濃度測定儀測定總DNA濃度，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組總DNA 16S r DNA V3區(qū)擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)［14］根據(jù)大腸桿菌16S rRNA基因V3片段(339～539 bp)設(shè)計(jì)合成引物。上游引物設(shè)計(jì)為帶GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)(帶下劃線的堿基序列)，序列為:5＇-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG T-3＇;下游引物序列為:5＇-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3＇。PCR反應(yīng)體系(25μL):上、下游引物(10 pmol/μL)各 1.0 μL，2 × Taq MasterMix 12μL，總 DNA(模板)1.0～2.0μL，雙蒸水補(bǔ)足25μL，同時設(shè)陰性對照管。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物片段大小和濃度。

1.5 PCR-DGGE分析

參照文獻(xiàn)［15］進(jìn)行PCR-DGGE，凝膠電泳梯度為35%～65%(100%的變性劑包括7 mol/L尿素和40%甲酰胺)，變性方向與電泳方向一致。采用1×TAE作電泳緩沖液，100 V、60℃電泳14～16 h，結(jié)果經(jīng)硝酸銀進(jìn)行染色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像。

1.6 割膠回收共性和特異性條帶并克隆和測序

將DGGE圖譜上的共性和特異性條帶分別割膠回收并浸泡在30μL加有0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的緩沖液中，4℃放置2 d。然后取1μL作為模板，按1.4方法再次擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳，確認(rèn)回收片段的正確性。重復(fù)該過程1～3次，直至在DGGE圖譜上得到單一的特定條帶。然后，取1μL回收純化的DNA為模板，采用1.4方法擴(kuò)增V3區(qū)，不同的是使用不帶GC發(fā)夾的引物，PCR產(chǎn)物用于下一步克隆。

采用pMD19-T載體試劑盒，參照使用手冊對模板PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，再將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含氨芐青霉素的營養(yǎng)瓊脂平板，每個條帶選取1～3個陽性克隆送英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司測序。應(yīng)用Chromas 2軟件對測定序列進(jìn)行編輯，非嵌合體序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，尋找親緣關(guān)系最近的細(xì)菌或克隆。

1.7 數(shù)據(jù)分析

將DGGE圖譜數(shù)字化、標(biāo)準(zhǔn)化后得到1個記錄DGGE膠中條帶遷移位置的數(shù)字化矩陣，將矩陣導(dǎo)入SAS 9.1軟件和NTSYS 2.1軟件進(jìn)行聚類分析及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃內(nèi)容物16SrDNAV3區(qū)基因片段的PCR-DGGE圖譜分析

瘤胃菌群數(shù)量龐大且種類繁多(圖1)，強(qiáng)的電泳條帶反映了瘤胃中的優(yōu)勢菌群，條帶數(shù)量和位置的復(fù)雜性代表細(xì)菌菌群的多樣性。不同纖維素富集培養(yǎng)基和溫度培養(yǎng)的瘤胃內(nèi)容物均產(chǎn)生了豐富的電泳條帶，但菌群結(jié)構(gòu)和組成存在較大差別。37℃條件下得到的樣品與50℃相比其細(xì)菌種類豐富度較高，用CMC培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品在37℃條件下平均條帶數(shù)為23，而在50℃條件下僅為15;同樣用PCS培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品在37℃條件下平均條帶數(shù)為19，而在50℃條件下為16。同一溫度條件下，條帶數(shù)多的樣品都集中分布在CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基，這可能與纖維素對細(xì)菌的富集有關(guān)。

2.2 PCR-DGGE圖譜的聚類分析

聚類分析結(jié)果(圖2)顯示，不同纖維素富集條件影響樣品細(xì)菌的多樣性，在37℃的瘤胃內(nèi)容物中，J培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基間的相似性系數(shù)為0.77;J培養(yǎng)基和CMC培養(yǎng)基間的相似性系數(shù)僅為0.76。在50℃的瘤胃內(nèi)容物中，J培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基間的相似性系數(shù)為0.78;而CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基間的相似性系數(shù)高達(dá)0.84。

溫度對瘤胃菌群的培養(yǎng)有一定影響，37℃的菌群聚為2個大族，而全部50℃的菌群聚為1個大族，PCS培養(yǎng)基和J培養(yǎng)基間的相似性系數(shù)在37℃僅為0.75，而在50℃高達(dá)0.97，這可能歸因于瘤胃菌群生存的環(huán)境溫度。

2.3 PCR-DGGE圖譜的主成分分析

對DGGE圖譜的主成分分析(圖3)同聚類分析的結(jié)果相一致。主成分因子1(PC1)的貢獻(xiàn)率為18.05%，主成分因子2(PC2)的貢獻(xiàn)率為10.02%;PC1明顯地將樣品分成2個部分，50℃的樣品主要分布在圖的右邊，37℃的樣品主要分布在圖的左邊;在50℃的樣品中，PC2將CMC培養(yǎng)基、PCS培養(yǎng)基和J培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品同K培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品區(qū)別開來;37℃的樣品中，PC2同樣將CMC培養(yǎng)基、PCS培養(yǎng)基和J培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品同K培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品基本分開。

圖1 不同培養(yǎng)基和溫度培養(yǎng)后瘤胃內(nèi)容物16S r DNA V3區(qū)基因片段的PCR-DGGE圖譜Fig.1 PCR-DGGE profiles of gene fragments of 16SrDNA V3region of rumen contents after cultured in different mediums at different temperatures

2.4 共性和特異性瘤胃菌群分析

DGGE圖譜上割膠回收的2個共性條帶和4個特異性條帶(圖1箭頭所指)，2個共性條帶為優(yōu)勢菌群，克隆測序后在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對分析，找出了最相近的菌種，結(jié)果見表1。不同條件培養(yǎng)后的瘤胃菌群結(jié)構(gòu)豐富，代表優(yōu)勢菌群的條帶屬于解沒食子酸鏈球菌(Streptococcus gallolyticus)和解脲芽孢桿菌(Ureibacillus themosphaericus)2個菌屬。本試驗(yàn)回收的幾個主要特異性條帶屬于解沒食子酸鏈球菌、摩氏假單胞菌(Pseudomonas mosselii)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)和未培養(yǎng)毛螺旋菌(uncultured Lachnospiraceae)4個菌屬。

在6個測序結(jié)果中，與GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌的同源性絕大多數(shù)都到達(dá)了100%，而條帶1和條帶4同數(shù)據(jù)庫中與之同源性最高的未培養(yǎng)微生物的相似性也達(dá)到了99%，說明試驗(yàn)中所得的序列與已鑒定的微生物親緣性非常高。

圖2 PCR-DGGE圖譜的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of PCR-DGGE profiles

圖3 PCR-DGGE圖譜的主成分分析Fig.3 PCA analysis of PCR-DGGE profiles

3 討論

3.1 不同培養(yǎng)條件下瘤胃內(nèi)容物16SrDNAV3區(qū)基因的PCR-DGGE圖譜分析

瘤胃菌群數(shù)量大，種類繁多，多樣性豐富［16］。DGGE圖譜(圖1)顯示不同培養(yǎng)基和溫度條件下，瘤胃細(xì)菌種類相當(dāng)豐富。CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基富含豐富的CMC-Na、微晶纖維素和纖維素粉等成分，為瘤胃纖維素降解菌提供了豐富的營養(yǎng)原料。瘤胃菌群多樣性在37℃條件下高于50℃時;CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基培養(yǎng)的瘤胃菌群多樣性高于J培養(yǎng)基和K培養(yǎng)基。閆韓韓等［17］研究飼喂添加葡萄糖、尿素和無機(jī)鹽的飼糧后，羊的瘤胃菌群種類和數(shù)量均呈現(xiàn)增加趨勢。馮薇等［18］采用PCR-DGGE分析比較了奶牛瘤胃中附著于苜蓿、青貯玉米和羊草3種飼料固相黏附微生物區(qū)系，發(fā)現(xiàn)其微生物菌群構(gòu)成存在差異。同樣，本研究采用不同培養(yǎng)基和溫度評估瘤胃菌群，發(fā)現(xiàn)在不同纖維素培養(yǎng)基和溫度下瘤胃內(nèi)容物DGGE圖譜存在較大差異，可能是因?yàn)榱鑫讣?xì)菌對不同環(huán)境條件表現(xiàn)出不同程度的適應(yīng)性。

3.2 PCR-DGGE圖譜的聚類分析和主成分分析

聚類分析及主成分分析結(jié)果顯示，對于同一份瘤胃內(nèi)容物樣品，37℃條件下用CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基所富集培養(yǎng)的菌群結(jié)構(gòu)較類似，可能是CMC和PCS2種培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分類似，為細(xì)菌的生長提供了比較類似的營養(yǎng)原料;而在50℃富集培養(yǎng)條件下，無論用CMC培養(yǎng)基，還是PCS培養(yǎng)基所富集培養(yǎng)的菌群結(jié)構(gòu)相似度非常高。因?yàn)榱鑫妇旱纳L環(huán)境溫度為39～41℃，對于大多數(shù)瘤胃細(xì)菌而言，溫度高于50℃條件下即引起死亡［19］，僅有少數(shù)耐高溫的細(xì)菌能生存下來，如耐高溫的解脲芽孢桿菌，所以CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基在50℃條件下的瘤胃菌群多樣性差異小。因此，對纖維素分解菌進(jìn)行富集培養(yǎng)時，可以從CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基中選取一種，同時選擇適當(dāng)?shù)臏囟取?/p>

表1 PCR-DGGE圖譜中共性和特異性條帶序列的Blast分析Table 1 Blast analysis of sequences of common and specific bands in PCR-DGGE profiles

3.3 不同纖維素富集培養(yǎng)條件下共性和特異性瘤胃菌群分析

孔慶亮等［20］應(yīng)用PCR-16S rDNA鑒定和動態(tài)監(jiān)測奶牛瘤胃菌群，鑒定出具有代表性的細(xì)菌為牛鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和嗜熱鏈球菌。同樣，本研究在不同纖維素富集培養(yǎng)條件下鑒定出的瘤胃優(yōu)勢菌為解沒食子酸鏈球菌和解脲芽孢桿菌。Kakimoto等［21］通過微生物純培養(yǎng)方法鑒定了瘤胃內(nèi)的產(chǎn)脲酶菌主要是鏈球菌屬(Streptococcus)。本試驗(yàn)通過CMC培養(yǎng)基培養(yǎng)后的特異性條帶鑒定為產(chǎn)堿桿菌，可能是因?yàn)镃MC培養(yǎng)基中含有的酵母粉為微生物的生長提供了充足的氮源及維生素等原料。而含豐富纖維素物質(zhì)的J培養(yǎng)基培養(yǎng)后的特異性條帶鑒定為未培養(yǎng)毛螺旋菌。Ghali等［22］從單峰駱駝和黑鹿中均鑒定出牛鏈球菌，而本試驗(yàn)從富含蛋白胨的PCS培養(yǎng)基培養(yǎng)后的特異性條帶鑒定為解沒食子酸鏈球菌，與其為同一屬。目前隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的瘤胃細(xì)菌信息被人們掌握，但研究發(fā)現(xiàn)瘤胃中仍有89%的細(xì)菌未被分離培養(yǎng)［7］，大量有價值的瘤胃細(xì)菌還有待探究。

4 結(jié)論

①不同纖維素富集培養(yǎng)基和溫度對瘤胃菌群的多樣性有一定程度上的影響。

②37℃條件下的瘤胃菌群多樣性高于50℃，50℃條件下可分離培養(yǎng)耐高溫細(xì)菌，如耐高溫解脲芽孢桿菌。

③不同培養(yǎng)基得到的瘤胃菌群存在一定差異，采用J培養(yǎng)基培養(yǎng)的瘤胃菌群多樣性程度低，但可作為分離某些難培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基，如未培養(yǎng)毛螺旋菌。

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