李志鵬 劉晗璐 崔學哲 荊 祎 鮑 坤 徐 超 楊福合 李光玉

(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟動物分子重點實驗室，長春 130112)

梅花鹿(Cervus nippon)屬于鹿科鹿屬的中型反芻動物，其產(chǎn)品(如鹿茸)具有較高的藥用價值。與其他反芻動物一樣，梅花鹿依賴瘤胃微生物將結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解為揮發(fā)性脂肪酸為機體提供能量。在自然條件下，梅花鹿采食范圍廣，而且對一些含有毒素的植物(如狼毒花、飛燕草和富含單寧枝葉等)具有耐受性［1］，這表明梅花鹿瘤胃微生物可能具有一定獨特性。楊鎰峰等［2］研究表明，飼糧中添加2%單寧可提高梅花鹿蛋白質(zhì)代謝率。Hiura等［3］發(fā)現(xiàn)北海道地區(qū)野生梅花鹿也喜采食單寧含量高的樹葉，并從瘤胃中分離到可有效降解單寧的鏈球菌屬(Streptococcus spp.)。Pope等［4］和 Sundset等［5－6］對挪威地區(qū)馴鹿瘤胃微生物區(qū)系研究表明，馴鹿瘤胃內(nèi)細菌主要由擬桿菌門和厚壁菌門細菌組成，細菌區(qū)系與其他反芻動物不同。而且Shi等［7］證明動物種類對瘤胃微生物有顯著影響。牦牛、大額牛、晉南牛和羊駝的瘤胃細菌多樣性的研究已有報道［8－11］，但基于非培養(yǎng)技術(shù)分析梅花鹿瘤胃細菌區(qū)系的研究卻較少。本研究對以柞樹葉為主要粗飼料的梅花鹿瘤胃細菌16SrRNA基因序列進行分析，研究梅花鹿瘤胃細菌區(qū)系，為豐富瘤胃微生物資源和揭示梅花鹿耐受單寧機制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用2頭2歲齡的裝有永久性瘤胃瘺管的成年雄性梅花鹿，平均體重130 kg，飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所茸鹿實驗基地(北緯44.04°，東經(jīng)129.09°)。每天09:00和16:00定時定量各飼喂1次，以放牧狀態(tài)下梅花鹿喜歡采食的柞樹葉為主要粗飼料(柞樹葉單寧含量為0.973%)，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。持續(xù)飼喂30 d(2011年10月1日至2011年10月31日)。第31天09:00飼喂之前通過瘤胃瘺管取瘤胃內(nèi)容物，置于冰盒中帶回實驗室，保存于－80°C冰箱備用。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the diet(air-dry basis) %

1.2 主要試劑

PCR相關(guān)試劑和酶購于TaKaRa公司;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(QIAEXⅡGel Extraction Kit)購于QIAGEN公司;克隆轉(zhuǎn)化試劑盒(TOPO TA Cloning Kit)購于Invitrogen公司。

1.3 基因組DNA提取

細菌基因組DNA提取按照Lamontagne等［12］和鄭剛等［13］方法進行，略作修改。取0.5 g瘤胃固液混合物，加入800μL溶菌酶溶液［0.15 mol/L氯化鈉，0.2 mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，10 mg/mL 溶菌酶，pH 8.0］和20 μL 蛋白酶K(20 mg/mL)。37℃、220 r/min震蕩1 h后，加入300μL裂解液［10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.1 mol/L 氯化鈉，0.5 mol/L 三羥甲基氨基甲烷 －鹽酸(Tris-HCl)緩沖液，pH 8.0］、300μL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)和600μL 苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液，65 ℃水浴 30 min，每隔10 min在渦旋振蕩儀上振蕩30 s。4℃、5 000 r/min離心6 min，上清中加入0.6倍體積異丙醇，－80℃沉淀15 min。70%乙醇洗滌沉淀2～3次。適量TE緩沖液(pH 8.0)溶解粗提DNA，試劑盒純化粗提基因組DNA。

1.4 16S r RNA基因擴增與克隆文庫構(gòu)建

細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')擴增細菌 16S rRNA 基因［14］。反應體系50μL，反應條件如下:95℃ 5 min;95℃30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 2 min(30個循環(huán));72℃10 min。利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。將來自2頭動物的等體積(10μL)PCR產(chǎn)物混合，按照試劑盒(TOPO TA Cloning Kit)說明書構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫。隨機挑選陽性克隆，用引物M13-47(5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')和 RV-M(5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')對陽性克隆進行驗證，確認PCR片段連接到載體。用上游引物27F對陽性克隆進行單向測序，測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.5 16S r RNA基因序列分析

Bellerophon軟件去除可能嵌合體序列［15］。使用Ribosomal Database Project(RDP)Release 10(RDP10)中 Classifer程序?qū)λ行蛄蟹诸悾?6］。MOTHUR 軟件劃分分類操作單元(OTU)［17］，將相似性大于97%的序列視為同一個OTU［18］。選取每個OTU代表序列，利用BLAST程序在NCBI中搜索相似性最高序列［19］。以嗜火產(chǎn)液菌(Aquifex pyrophilus)為外群，利用 MEGA 5.05軟件中ClustalW比對后輸出為同一長度序列，利用Kimura-two參數(shù)矩陣模型和鄰接法(neighbor-joining，NJ)進行系統(tǒng)發(fā)育分析，設(shè)置 Bootstrap值為1 000［20］。

2 結(jié)果

2.1 16S r RNA基因克隆文庫分析

本試驗共獲得128個16S rRNA基因序列，其中21個為可能嵌合體序列。RDP分類表明107個克隆序列代表擬桿菌門和厚壁菌門細菌，所占比例分別為87.9%和12.1%。以97%序列相似性為閾值，107個序列分為22個 OTUs(表2)。MOTHUR計算表明克隆文庫庫容值為84.3%，滿足分析要求。

表2 梅花鹿瘤胃細菌16S r RNA基因序列分析Table 2 Sequence analysis of bacteria 16S rRNA gene from the rumen of sika deer

107個序列中91個序列(10個OTUs)與已培養(yǎng)細菌的16S rRNA序列相似性≥97%，占總序列的85%。這些已培養(yǎng)菌包括:棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)(6 個 OTUs，81.4%總克隆序列)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)(1個 OTU，0.9% 總克隆序列)、Dialister succinatiphilus(1 個 OTU，0.9%總克隆序列)、Sharpea azabuensis(1個 OTU，0.9%總克隆序列)和規(guī)則糞球菌(Coprococcus eutactus)(1個 OTU，0.9%總克隆序列)。13個序列(10個OTUs，12.2%總克隆序列)與已培養(yǎng)菌16S rRNA序列相似性處于90%～97%，包括:棲瘤胃普雷沃氏菌(2個OTUs，3.7%總克隆序列)、溶纖維丁酸弧菌(2個OTUs，1.8%總克隆序列)、棲牙普雷沃氏菌(Prevotella denticola)(2 個 OTUs，2.8% 總克隆序列)、Dialister succinatiphilus(1 個 OTU，0.9%總克隆序列)、Solobacterium moorei(1 個 OTU，0.9% 總克隆序列)、Syntrophococcus sucromutans(1個 OTU，0.9%總克隆序列)和糞便羅斯拜瑞氏菌(Roseburia faecis)(1個 OTU，0.9%總克隆序列)。其余3個序列(2個OTUs，2.8%總克隆序列)與解溶紙梭菌(Clostridium papyrosolvens)相似性＜90%。

2.2 16S r RNA基因系統(tǒng)進化分析

22個OTUs代表序列與24條相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明所有序列歸類于擬桿菌門和厚壁菌門2大簇(圖1)。所有與普雷沃氏菌屬(Prevotella spp.)相似序列均聚在擬桿菌門簇，3個相似性低的序列(SDX18、SDX64和SDX68)雖與已培養(yǎng)普雷沃氏菌屬聚在一起，但系統(tǒng)發(fā)育距離較遠，因此可能代表新的普雷沃氏菌屬。厚壁菌門簇中，發(fā)育關(guān)系更為復雜，個別序列并未與其相似序列聚為一類。如糞便羅斯拜瑞氏菌相似序列SDX97(96%)與 Syntrophococcus sucromutans在發(fā)育關(guān)系上更近;溶纖維丁酸弧菌相似序列(SDX56和SDX65)并未與溶纖維丁酸弧菌聚在一起;Dialister succinatiphilus相似序列 SDX12(92%)與Solobacterium moorei聚為一類;SDX103和SDX107與解溶紙梭菌聚為一類，但發(fā)育距離較遠，而且SDX103與牛回腸黏膜未培養(yǎng)細菌序列相似性達到100%，SDX107與黃牛瘤胃中未培養(yǎng)細菌序列相似性為99.6%，因此這些序列可能代表新的未培養(yǎng)的屬或種。

圖1 梅花鹿瘤胃細菌16S r RNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of bacteria 16S rRNA gene sequences from the rumen of sika deer

3 討論

瘤胃是一個含有大量微生物的厭氧生態(tài)系統(tǒng)，其中含有細菌 1010～1011個/mL、古菌 107～109個/mL、原蟲 104～106個/mL、真菌 103～106個/mL和病毒 109～ 1010個/mL［21］，這些微生物在降解植物纖維和含毒素植物中發(fā)揮著重要作用。在放牧狀態(tài)下，梅花鹿喜采食單寧含量高的柞樹葉。因此，對以柞樹葉為主要粗飼料的梅花鹿瘤胃細菌區(qū)系進行分析，可為揭示梅花鹿耐受高單寧機制提供依據(jù)。

梅花鹿瘤胃細菌區(qū)系結(jié)果表明，87.9%的16S rRNA基因序列屬于與纖維降解密切相關(guān)的擬桿菌門，而Pope等［4］等發(fā)現(xiàn)挪威馴鹿瘤胃中61%細菌屬于擬桿菌門，這可能是因為動物種類或地理環(huán)境差異所導致。普雷沃氏菌屬是瘤胃中存在數(shù)量最為豐富的一類細菌［22－24］，它們可利用多種多糖，并可促進木聚糖的降解［25－26］。梅花鹿瘤胃中87.9%的16S rRNA基因序列與普雷沃氏菌屬相似，而且明顯比奶牛(68.5%和 42% ～60%)［24，27］、山羊(19.7%)［22］和 羊駝(40%)［10］瘤胃中普雷沃氏菌屬比例高，這表明普雷沃氏菌屬在梅花鹿瘤胃發(fā)酵中發(fā)揮重要作用。盡管有研究認為，飼糧中添加精飼料可能會導致普雷沃氏菌屬在瘤胃中數(shù)量增加［28－29］，但梅花鹿瘤胃中普雷沃氏菌屬的種類和數(shù)量更可能是梅花鹿與瘤胃內(nèi)微生物互相選擇、共同進化的結(jié)果。

梅花鹿瘤胃中存在溶纖維丁酸弧菌，但未發(fā)現(xiàn)牛、羊瘤胃中常見的纖維素降解菌，如瘤胃球菌屬(Ruminococcus spp.)和琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)。McSweeney 等［30］發(fā)現(xiàn)山羊采食含有單寧的危地馬拉朱纓花(Calliandra calothyrsus)后，瘤胃中瘤胃球菌屬和琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量減少，這說明單寧能夠影響瘤胃中纖維素降解菌的種類。因此，本研究中未檢測到瘤胃球菌屬和琥珀酸絲狀桿菌可能是因為柞樹葉中存在的單寧與瘤胃中細菌細胞壁或細胞結(jié)合性胞外酶發(fā)生反應，細菌可利用養(yǎng)分減少，生長受到抑制。而Jones等［31］報道，棲瘤胃普雷沃氏菌和梭菌屬(Clostridium spp.)細菌對縮合單寧具有耐受性，同時McSweeney等［32］發(fā)現(xiàn)同一種中不同菌株型對單寧表現(xiàn)出不同的耐受性。另外，由于普雷沃氏菌屬具有很高的遺傳多樣性［22］，因此，我們推測梅花鹿對單寧耐受性可能與瘤胃中大量存在的普雷沃氏菌屬有關(guān)。

序列分析結(jié)果表明梅花鹿瘤胃中存在Dialister succinatiphilus、Solobacterium moorei、Syntrophococcus sucromutans、糞便羅斯拜瑞氏菌、規(guī)則糞球菌和Sharpea azabuensis，這些細菌也發(fā)現(xiàn)于其他反芻動物瘤胃中［23］。王夢芝等［33］認為瘤胃羅斯拜瑞氏菌屬(Roseburia sp.)的丁酰輔酶 A(CoA):乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶可轉(zhuǎn)化乙酸產(chǎn)生丁酸，形成菌種間的交互飼喂，保證瘤胃發(fā)酵的流暢性。糞球菌屬(Coprococcus sp.)具有降解間苯三酚的功能［34］?？紤]到單寧是一種酚類聚合物，所以，梅花鹿瘤胃中糞球菌屬也可能參與降解單寧的過程。有研究報道，單寧可以減少反芻動物甲烷排放量［35－36］。因此，這些細菌可能在梅花鹿瘤胃中具有其他重要功能。因此，研究不同粗飼料對梅花鹿瘤胃中細菌多樣性的影響，將有助于理解梅花鹿對單寧的耐受機制。

4 結(jié)論

①本研究對以富含單寧的柞樹葉為主要粗飼料來源的梅花鹿瘤胃細菌多樣性進行了初步分析，普雷沃氏菌屬是梅花鹿瘤胃內(nèi)優(yōu)勢細菌，但普雷沃氏菌屬相似克隆序列比例與其他反芻動物有一定區(qū)別，可能是梅花鹿與瘤胃微生物互相選擇、共同進化的結(jié)果。

②常見的纖維素降解菌未檢測到可能與飼料中單寧含量高有關(guān)。

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