彭程遠 解 俊 金 珊 趙青松 陳寅兒 王國良

(寧波大學海洋學院，寧波 315211)

諾卡氏菌(Nocardia)是一種革蘭氏陽性絲狀桿菌，屬于放線菌類微生物，它是水產(chǎn)動物諾卡氏菌病的主要致病菌，可引起五條 (Seriola quinqueradiata)、海鱸(Lateolabrax japonicus)、大黃魚(Pseudosciaena crocea)、烏鱧(Channa argus)等多種養(yǎng)殖魚類的嚴重死亡［1］。魚類諾卡氏菌病由于發(fā)生延續(xù)流行時間長，從感染至死亡的時間一般需15 d以上，且早期體表無明顯癥狀，因此至今還沒有很好的技術(shù)手段來預防和治療該?。?］。

肽聚糖(peptidoglycan，PG)是細菌細胞壁的重要組成部分，是一種強免疫增強劑，主要通過誘導各種免疫調(diào)控物質(zhì)的釋放或表達來刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫功能［3］。全肽聚糖(whole peptidoglycan，WPG)是指未經(jīng)物理破碎并保持細菌細胞壁骨架“袋形”結(jié)構(gòu)完整性的肽聚糖［4］。研究表明，WPG是一種生物反應調(diào)節(jié)劑，它在動物體內(nèi)體外都能激活免疫細胞、活化補體并調(diào)節(jié)機體的體液免疫和細胞免疫應答，表現(xiàn)出較強的免疫賦活作用，且其免疫活性與其細胞壁物理形態(tài)的完整程度呈正相關(guān)［5-7］。

魚類非特異性免疫機制主要包括細胞防御和體液防御，其細胞防御主要是通過各種血細胞的吞噬作用來實現(xiàn)的，而體液防御因子分布于血清、黏液及組織細胞中，主要有溶菌酶等多種酶、補體、干擾素、凝集素等，它們能非特異性地抑制多種微生物的生長［8-9］。為了明確WPG對魚類非特異性免疫力的調(diào)節(jié)作用，本試驗根據(jù)魚類的免疫特點［9］和其他學者的研究資料［10-16］篩選出了與魚類非特異性免疫相關(guān)的檢測指標，研究了 魚諾卡氏菌(Nocardia seriolae)WPG對烏鱧黏液、血清及肝臟、腎臟組織中主要非特異性免疫指標的影響，以期為魚類諾卡氏菌病免疫防治尋找新的契機，為諾卡氏菌亞單位疫苗的研制及免疫增強劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗用烏鱧購自寧波市水產(chǎn)市場，體重300～400 g，共250尾，養(yǎng)于室內(nèi)大水族箱中，并用遮陽布適當遮蓋。根據(jù)水質(zhì)情況每天及時吸出糞便并用事先曝氣處理的自來水換水1～2次，每次換水1/3，試驗期間連續(xù)充氧，每天投喂魚體重5%的小雜魚，早晚各1次。

1.3 樣品的制備

將100尾烏鱧分為試驗組和對照組，每組5個重復，每個重復10尾。試驗組每尾腹腔注射0.3 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的 魚諾卡氏菌WPG溶液，對照組同法等量注射0.7%滅菌生理鹽水。于腹腔注射后第 0、1、2、3、4、5、6、7、8 天隨機從各重復中取5尾魚進行樣品的采集。首先采集魚體表黏液，參照陳昌福等［17］的方法進行;然后用注射器尾靜脈采血，所采血液分為2份，一份不抗凝，取出后直接放入離心管中4℃靜置2 h后，4℃離心(3 000 r/min)10 min，取上層血清冷藏待測，另一份用無菌肝素鈉抗凝，用于血細胞吞噬指數(shù)(phagocytic index，PI)的測定;最后無菌操作解剖魚取肝臟和頭腎組織，冷藏待測。

1.4 樣品的處理

1.4.1 黏液的處理［18］

將收集有黏液的Eppendorf管于4℃下3 000 r/min離心，用移液槍槍頭吸掉管底的重力水，稱重記錄數(shù)據(jù)，扣除空Eppendorf管管重(取20個管的均值)后得黏液凈重，按所得黏液凈重加入9倍重量的滅菌生理鹽水，冰浴勻漿后于4℃離心(10 000 r/min)15 min，取上清液分裝，冷藏待測。

1.4.2 組織的處理

分別取肝臟和頭腎，經(jīng)滅菌生理鹽水潤洗，吸水紙吸去表面水分后稱重，取各組織塊0.2 g，加入9倍重量的滅菌生理鹽水，后續(xù)操作同1.4.1。

1.5 血細胞吞噬指數(shù)的測定

取0.3 mL抗凝血，等量加入酵母菌懸液(6.0×108cell/mL)，邊加邊搖，28℃放置45 min，每隔10 min左右搖1次，取出后1 500 r/min離心5 min。棄去上清液后取表層細胞制成血涂片，自然干燥后甲醇固定5 min，吉姆薩(Giemsa)染色15～20 min，風干后油鏡下隨機觀察50個參與吞噬的細胞，記錄吞噬細胞內(nèi)酵母菌總數(shù)，計算吞噬指數(shù)。

1.6 血清替代途徑補體活力(alternative complement pathway activity，ACH50)的測定

ACH50的測定參照Yano［18］的方法進行。先將保存在阿氏液(Alsever’s solution)中的兔紅血細胞用緩沖液EGTA-Mg2+-GVB緩沖液沖洗3遍后，用該緩沖液將其濃度調(diào)至2.0×108cell/mL，再將待測血清也用上述緩沖液稀釋20倍備用。取7支離心管，其中1～6號離心管分別加入0、0.050、0.090、0.125、0.150、0.250 mL EGTA-Mg2+-GVB緩沖液，并加入事先稀釋好的血清，使每支離心管中總體積為0.250 mL;7號離心管為100%溶血對照管，僅加入3.400 mL蒸餾水。同時向每一離心管中加入0.100 mL濃度為2.0×108cell/mL的兔紅血細胞，20℃溫育90 min，期間不斷搖動，反應結(jié)束后立即將所有離心管放入冰浴中終止反應，然后向1～6號離心管中加入3.15 mL的生理鹽水。所有離心管在1 600×g下離心5 min，取上清液在414 nm下測定吸光度(OD)值，以未加血清的6號離心管作為空白對照。樣品的溶血度由相應的OD值除以100%溶血對照管的OD值求出Y，以Y/(1-Y)為橫坐標，以對應的血清體積X(mL)為縱坐標作圖，將產(chǎn)生50%溶血時的血清體積記為K。

血清ACH50(unit/mL)=1/K×血清稀釋倍數(shù)。

1.7 酶活力及蛋白質(zhì)含量的測定

血清、黏液、肝臟及頭腎組織中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(LSZ)活力及蛋白質(zhì)含量的測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行。

1.8 魚諾卡氏菌WPG對烏鱧的攻毒保護試驗

將150尾烏鱧分為免疫組和對照組，每組75尾。免疫組每尾腹腔注射0.3 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的 魚諾卡氏菌WPG溶液，對照組同法等量注射0.7%滅菌生理鹽水。在免疫后的第7、21、35天，分別從免疫組和對照組各取20尾魚用濃度約為3.0×108CFU/mL的 魚諾卡氏菌菌懸液腹腔注射0.2 mL/尾進行攻毒試驗，逐日觀察記錄烏鱧45 d內(nèi)的死亡情況并計算免疫保護率。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。以t檢驗進行差異顯著性檢驗:P＞0.05，不存在顯著差異;P＜0.05，存在顯著差異;P＜0.01，存在極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚諾卡氏菌WPG對烏鱧血細胞吞噬指數(shù)的影響

烏鱧紅細胞和白細胞都具有吞噬異物的功能，它們對酵母菌的吞噬作用分別見圖1和圖2。注射 魚諾卡氏菌WPG后烏鱧血細胞吞噬指數(shù)的變化見表1。與對照組相比，試驗組烏鱧紅細胞和白細胞吞噬指數(shù)均在注射后第1天就顯著或極顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，在第2天達峰值，隨后紅細胞和白細胞吞噬指數(shù)均逐漸下降，在注射后第3天、第4天紅細胞吞噬指數(shù)仍顯著或極顯著高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)。

圖1 紅細胞對酵母菌的吞噬作用Fig.1 Phagocytosis of erythrocytes on yeast(1 000×)

圖2 白細胞對酵母菌的吞噬作用Fig.2 Phagocytosis of leukocytes on yeast(1 000×)

2.2 魚諾卡氏菌WPG對烏鱧血清ACH50的影響

2.3 魚諾卡氏菌WPG對烏鱧不同組織中ACP活力的影響

表1 注射 魚諾卡氏菌WPG后烏鱧血細胞吞噬指數(shù)的變化Table 1 The variation of haemocytes phagocytic index of Channa argus after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) %

表2 注射 魚諾卡氏菌WPG后烏鱧血清ACH50的變化Table 2 The variation of serum ACH50 of Channa argus after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) unit/mL

表3 注射魚諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中ACP活力的變化Table 3 The variation of ACP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/dL

表3 注射魚諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中ACP活力的變化Table 3 The variation of ACP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/dL

時間點Time points組織Head kidney第0天 試驗組 Experimental group 21.79±2.90 55.20±5.20 398.02±15.53 427.42±20.55 Day 0 對照組 Control group 22.10±2.57 53.41±5.33 399.35±3.20 428.50±27.68第1天 試驗組 Experimental group 28.95±1.90＊＊ 74.87±12.80＊＊ 517.15±19.05＊＊ 510.44±8.71＊＊Day 1 對照組 Control group 20.91±2.69 52.24±3.49 405.52±10.24 431.27±15.51第2天 試驗組Experimental group 24.69±0.89* 87.52±4.24＊＊ 415.56±24.28 464.62±28.03*Day 2 對照組 Control group 22.29±2.83 51.72±5.36 401.67±6.68 434.96±20.01第3天 試驗組 Experimental group 26.66±2.23* 60.14±8.65 406.21±10.57 514.13±26.94*Day 3 對照組 Control group 22.63±2.40 55.58±8.37 401.42±14.10 446.20±9.38第4天 試驗組Experimental group 40.92±1.33＊＊ 57.60±4.48 598.76±28.41＊＊ 474.74±18.50*Day 4 對照組 Control group 21.41±2.30 50.12±2.21 399.91±16.70 422.45±25.24第5天 試驗組Experimental group 30.63±1.74＊＊ 58.27±6.02 402.31±12.66 452.47±11.36 Day 5 對照組 Control group 20.89±1.02 50.47±3.29 390.23±30.95 437.47±10.67第6天 試驗組Experimental group 32.08±2.31＊＊ 52.19±5.56 443.30±31.52* 504.53±15.32＊＊Day 6 對照組 Control group 21.75±1.96 49.55±7.40 400.89±15.37 433.22±19.84第7天 試驗組 Experimental group 31.14±2.39* 57.03±1.78 424.07±15.84 541.66±22.56＊＊Day 7 對照組 Control group 22.09±2.44 51.08±5.93 401.54±20.52 425.73±16.71第8天 試驗組 Experimental group 31.81±2.92* 58.27±5.12 404.76±22.90 487.25±33.15*Day 8 對照組 Control group 22.31±3.36 51.68±9.01 391.00±16.64 437.97±3.50組別Groups Tissues血清Serum 黏液Mucus 肝臟Liver 頭腎

表4 注射魚諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中AKP活力的變化Table 4 The variation of AKP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) 金氏單位/dL

表4 注射魚諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中AKP活力的變化Table 4 The variation of AKP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) 金氏單位/dL

時間點Time points組織Head kidney第0天 試驗組 Experimental group 7.10±1.35 51.67±2.54 205組別Groups Tissues血清Serum 黏液Mucus 肝臟Liver 頭腎.44±8.67 468.36±28.56 Day 0 對照組 Control group 7.00±2.52 52.43±1.21 203.17±8.25 469.64±27.02第1天 試驗組 Experimental group 7.99±1.96 50.78±6.92 209.63±16.86 490.15±26.49 Day 1 對照組 Control group 6.67±1.12 48.47±6.68 206.05±10.22 462.79±20.06第2天 試驗組 Experimental group 8.53±2.12 47.84±2.75 210.08±29.05 468.23±24.95 Day 2 對照組 Control group 7.28±2.81 46.31±4.63 204.73±19.67 462.08±28.81第3天 試驗組 Experimental group 8.10±1.30 47.47±8.17 241.81±25.80* 474.54±25.43 Day 3 對照組 Control group 7.72±0.97 50.27±11.03 202.42±11.42 464.97±26.95第4天 試驗組Experimental group 9.33±0.98* 56.23±2.80 264.13±24.73＊＊ 471.25±26.01 Day 4 對照組 Control group 7.95±1.82 53.68±1.61 200.52±21.77 474.90±23.72第5天 試驗組 Experimental group 8.12±1.24* 50.24±3.71 203.03±11.85 478.49±26.84 Day 5 對照組 Control group 7.56±0.75 48.83±3.05 200.97±13.69 475.43±27.33第6天 試驗組Experimental group 16.16±1.98＊＊ 49.22±12.62 219.39±21.31 469.52±24.65 Day 6 對照組 Control group 8.45±1.19 51.27±9.22 198.50±23.74 469.16±18.27第7天 試驗組 Experimental group 9.60±0.41* 50.31±3.72 205.38±15.26 475.21±22.11 Day 7 對照組 Control group 8.15±1.12 46.23±11.32 191.18±28.60 475.08±22.22第8天 試驗組 Experimental group 9.51±0.32 48.95±7.88 192.43±20.60 480.79±7.53 Day 8 對照組 Control group 8.90±1.72 50.32±6.66 191.27±16.55 468.65±26.52

表5 注射魚諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中SOD活力的變化Table 5 The variation of SOD activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/mL

表5 注射魚諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中SOD活力的變化Table 5 The variation of SOD activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/mL

時間點Time points組織Head kidney第0天 試驗組 Experimental group 108.82±17.65 20.18±3.48組別Groups Tissues血清Serum 黏液Mucus 肝臟Liver 頭腎13.26±1.52 6.42±1.45 Day 0 對照組 Control group 107.96±17.66 20.76±1.20 13.56±1.64 6.38±0.80第1天 試驗組 Experimental group 136.53±14.45* 23.33±2.79* 14.81±1.90 7.39±1.29 Day 1 對照組 Control group 103.00±10.62 20.17±2.03 14.13±1.42 7.15±1.00第2天 試驗組Experimental group 152.35±6.37＊＊ 28.91±1.28＊＊ 13.93±1.23 7.54±1.50 Day 2 對照組 Control group 110.29±2.68 20.61±2.55 12.75±1.82 7.22±1.51第3天 試驗組Experimental group 144.92±16.35＊＊ 26.17±0.86＊＊ 13.06±2.39 7.46±1.17 Day 3 對照組 Control group 105.00±13.53 19.44±1.01 13.05±0.15 7.01±1.82第4天 試驗組Experimental group 184.00±24.20＊＊ 26.87±0.54＊＊ 14.40±1.87 6.77±0.86 Day 4 對照組 Control group 105.42±24.05 18.76±2.56 12.24±1.26 6.52±1.26第5天 試驗組Experimental group 139.44±5.96＊＊ 27.95±3.01＊＊ 13.56±1.38 6.89±0.77 Day 5 對照組 Control group 108.91±14.68 20.60±3.22 12.31±2.35 7.07±1.80第6天 試驗組 Experimental group 135.51±7.25* 22.99±1.01* 14.12±1.16 6.74±1.91 Day 6 對照組 Control group 117.65±21.77 18.24±2.02 14.45±0.39 6.20±0.69第7天 試驗組Experimental group 140.17±16.23＊＊ 23.25±3.23* 13.37±3.53 6.91±1.38 Day 7 對照組 Control group 100.53±14.19 20.42±2.66 13.15±2.58 6.91±0.42第8天 試驗組Experimental group 120.95±3.27 26.37±0.69＊＊ 14.09±2.90 6.66±1.56 Day 8 對照組 Control group 106.13±15.11 20.26±3.25 13.79±2.98 6.61±1.07

2.6 魚諾卡氏菌WPG對烏鱧不同組織中LSZ活力的影響

2.7 魚諾卡氏菌WPG對烏鱧的免疫保護效應

3 討論

魚類屬于低等脊椎動物，其非特異性體液免疫因子和吞噬細胞在機體的免疫防御過程中起著主導的作用［8］。有研究表明，魚類除了白細胞外，其紅細胞也具有吞噬功能［19-21］，這在本試驗中也得到了證實(圖1)。王旭東等［21］認為這主要是因為紅細胞和白細胞都來源于造血干細胞，即使后來由于細胞的分化使白細胞獲得了各種免疫防御機能，而紅細胞則成為攜帶氧和調(diào)節(jié)體液酸堿和離子平衡者，但紅細胞仍保持了對異物的黏附和吞噬的免疫功能，這可能與它們細胞膜中含有糖基磷脂酰肌醇有關(guān)，且紅細胞的黏附和吞噬功能在低等動物中更加明顯。本試驗結(jié)果顯示， 魚諾卡氏菌WPG可以較快地刺激烏鱧紅細胞和白細胞的吞噬能力，且對紅細胞吞噬能力的促進更大，這與溫安祥等［22］的研究結(jié)果類似。

魚類補體直接參與機體防御，其生物學活性影響機體抵抗微生物的能力、免疫反應細胞間的通訊聯(lián)系、免疫復合物的形成和持續(xù)時間等，而ACH50是衡量魚類非特異性免疫力的一項重要指標［23］。本試驗結(jié)果顯示，注射 魚諾卡氏菌WPG后第1天烏鱧的血清ACH50就極顯著升高，在注射后的4 d內(nèi)均顯著高于對照組，這與張璐等［10］、張春曉等［11］、周進等［24］的研究結(jié)果基本一致，說明 魚諾卡氏菌WPG具有激活魚類補體系統(tǒng)的作用。

表6 注射 魚諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中LSZ活力的變化Table 6 The variation of LSZ activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/mL

表7 魚諾卡氏菌WPG對烏鱧的免疫保護效應Table 7 Immune protective efficacy of WPG from Nocardia seriolae on Channa argu

ACP主要存在于肝臟、腎臟、血液、骨骼等組織中，是溶酶體的標志酶;AKP主要存在于骨骼、肝臟和血液中，可催化有機磷酸酯水解，通過改變細菌表面結(jié)構(gòu)增強其異己性，從而被免疫細胞識別達到免疫防御的作用［12，25］，它們都是動物體內(nèi)參與免疫防御的重要水解酶，可作為衡量動物體非特異性免疫力的指標［9］。本試驗結(jié)果表明，對照組烏鱧ACP活力肝臟＞腎臟＞黏液，AKP活力腎臟＞肝臟＞黏液，這與周進等［13］的研究結(jié)果相似;而 魚諾卡氏菌WPG能顯著提高烏鱧血清、頭腎、肝臟、黏液中ACP活力及血清、肝臟中AKP活力，但對頭腎和黏液中AKP活力沒有顯著影響，作者認為這可能與ACP和AKP的功能及它們與不同組織的親和性等有關(guān)。關(guān)于表3中部分組織ACP活力出現(xiàn)多峰的現(xiàn)象，作者推測一方面魚諾卡氏菌WPG作為已知的病原模式分子進入魚體后可以激活肽聚糖結(jié)合蛋白等模式識別受體，從而引起多種免疫應答反應，包括ACP的產(chǎn)生和激活［26］;另一方面ACP是溶酶體中的主要水解酶，而溶酶體具有防御和消化的雙重功能， 魚諾卡氏菌WPG作為機體的異物，在它完成免疫調(diào)節(jié)作用后必須被消化清除，因而造成了ACP活力的又一次增強;此外，由于魚類是變溫動物，外界環(huán)境因素及試驗操作都有可能影響其組織中酶的活力，但這些均還需要進一步的試驗證實。

SOD主要是清除動物體液或組織中的超氧基，在防御細胞組織超氧陰離子()毒性、生物分子損傷方面起著十分重要的作用［14］。周進等［16］研究表明，牙鲆組織中SOD活力黏液 ＞肝臟＞腎臟，投喂肽聚糖后對肝臟、腎臟、血清中SOD活力沒有顯著影響，而不同的投喂方式對黏液中SOD活力有顯著影響;宋曉玲等［15］的研究發(fā)現(xiàn)，肽聚糖能適當提高日本對蝦血清中SOD活力，但影響不顯著。本研究結(jié)果顯示，烏鱧在注射魚諾卡氏菌WPG后肝臟和頭腎中SOD活力無顯著變化，而血清和黏液中SOD活力均有所升高，作者認為這與SOD的功能有關(guān)，因為黏液是機體免疫保護的第1道屏障，而血液可以進入機體的各個組織和器官，因此血清和黏液中SOD活力的升高說明 魚諾卡氏菌WPG可以促進機體對有毒物質(zhì)清除的加強，提高機體免疫力［16］。

LSZ由單核細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞等產(chǎn)生，主要存在于動物的分泌液和血清中，在機體抵抗病原微生物的防御中起著重要作用［27］。本研究結(jié)果表明，烏鱧LSZ活力血清＞頭腎＞肝臟＞黏液，而注射 魚諾卡氏菌WPG后烏鱧各組織中LSZ活力都發(fā)生了明顯的變化，尤其是黏液、血清和肝臟，其LSZ活力在一定時間內(nèi)升高極顯著，但變化趨勢不盡相同，這與張璐等［10］、張春曉等［11］和宋曉玲等［15］的研究結(jié)果基本相同。Di Luzio［28］認為免疫多糖可以促進單核細胞或巨噬細胞的增生，激活它們分泌LSZ。由于本試驗是采用腹腔注射免疫的方法，因此作者推測當注射 魚諾卡氏菌WPG后烏鱧血液和肝臟組織中的巨噬細胞等首先被激活并進行增生和分泌LSZ，黏液中LSZ主要是魚體應激分泌產(chǎn)生，而 魚諾卡氏菌WPG對頭腎的作用相對稍晚，短時間內(nèi)主要是促進免疫細胞的增生和分化，因此頭腎中LSZ活力上調(diào)沒有黏液、血清和肝臟等組織明顯。

4 結(jié)論

［1］袁思平，王國良，金珊.養(yǎng)殖魚類致病諾卡氏菌研究進展［J］.微生物學通報，2006，33(2):137-141.

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