劉京敏，董金波，王維山，孫益明，彭方亮，張 杰

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨一科，新疆石河子832000）

Neuritin是以色列科學(xué)家Nedivi發(fā)現(xiàn)的可促進神經(jīng)突起的快速生長的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。近年通過對Neuritin的不斷研究發(fā)現(xiàn)，Neuritin可以穩(wěn)定樹突棘上突觸的活性，促進突觸成熟［1］，并且Neuritin是神經(jīng)活動和神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮作用的共同下游因子，與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)［2－3］。另外，Neuritin還能促進真皮微血管內(nèi)皮細胞增殖和聚集形成［4］，且作為一種新型血管生長因子在機體中起作用［5］。另有研究顯示，除了神經(jīng)系統(tǒng)，Neuritin在肝、心、肺、骨骼?。?－7］等其他多個正常組織器官都有表達。作者前期動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，在腦外傷合并骨折模型中，其血清中Neuritin的含量較健康大鼠及單純骨折的大鼠明顯升高［8］。本研究通過口服及局部注射兩種途徑來探討Neuritin對骨折愈合的影響，這將有助于設(shè)計新型藥物干預(yù)手段或新的治療途徑加速骨折愈合，從而對臨床骨折治療提供重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動物實驗室完成，采用健康成年雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量（275±25）g，由新疆動物實驗中心提供。Neuritin重組蛋白購自美國Sigma公司（生產(chǎn)批號：ab69775）?？逻_DR3000攝片機（日本柯達公司）；佳能A80數(shù)碼照相機（日本佳能公司）；Leica2135型石蠟切片機 （德國萊卡公司）；電鉆、直徑1mm克氏針（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠股骨骨折模型建立及實驗方法 將SD大鼠用濃度為100g／L的水合氯醛按照體質(zhì)量（300mg／kg）進行腹腔注射麻醉，無菌條件下取右側(cè)股骨外側(cè)切口，縱行切開約2cm，顯露股骨中斷，截斷后選擇直徑為1mm克氏針?biāo)枨荒嫘泄潭?，術(shù)后應(yīng)用青霉素鈉肌注，連續(xù)7d，分籠喂養(yǎng)允許自由活動。Ⅰ組不做特殊處理，Ⅱ組于術(shù)后第3天開始用灌胃管向大鼠胃中注入含0.025μL／L Neuritin的生理鹽水0.3mL，每日1次，連續(xù)灌胃7d；Ⅲ組于術(shù)后第3天開始，在大鼠骨折斷端局部注射含0.025μL／L Neuritin的生理鹽水0.3mL，每日1次，連續(xù)注射7d；各組分別于術(shù)后1、2、3周分期采用頸椎脫臼法處死8只大鼠，并于骨折部位取材。

1.2.2 大體觀察 于預(yù)計的時間點麻醉良好后，行X線拍片觀察骨折愈合影像學(xué)觀察。在處死后取出骨折斷端的骨痂標(biāo)本，肉眼觀察其大體骨痂生長情況和骨折愈合情況，以骨痂Nordsletten X線評分標(biāo)準評分。

1.2.3 骨痂體積測量［9］在剔除骨痂周圍組織后，采用Perkins骨痂體積測量公式：2πR1（R2－R1）L測量各組骨痂體積，其中R1表示股骨半徑，R2表示骨痂半徑，L表示骨痂長度。

1.2.4 骨痂病理學(xué)檢測（HE染色） 保留骨痂兩側(cè)各約1cm骨組織截骨，常溫下4%的多聚甲醛固定48h后，再用蒸餾水浸泡4h，最后經(jīng)EDTA－2Na（乙二胺四乙酸二鈉）脫鈣4～6周。常規(guī)脫水石蠟包埋、切片。光鏡下觀察新生骨小梁、軟骨細胞、成骨細胞和骨重塑等細胞組織學(xué)形態(tài)變化。以骨痂組織學(xué)評分方法評分。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)采用方差分析，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大體標(biāo)本觀察及骨痂體積測量 1周時Ⅰ組骨折斷端明顯可分離，Ⅱ、Ⅲ組骨折兩端可見局部的血腫機化組織，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。2周時Ⅰ組斷端機化組織明顯增多，但是局部未見骨痂組織；Ⅲ組骨痂觸之質(zhì)韌，有彈性，可見纖維骨痂完整連接。3周時Ⅰ組局部出現(xiàn)略小的梭型骨痂，部分纖維骨痂未完整連接；Ⅲ組骨痂觸之質(zhì)硬，有骨性骨痂的連接，部分已經(jīng)骨化；Ⅱ組骨痂膨隆較前明顯增大，部分骨痂已經(jīng)出現(xiàn)骨性愈合。骨痂體積測量顯示，Ⅱ、Ⅲ組明顯大于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅲ組明顯大于Ⅱ組（P＜0.05），見表1。

圖1 骨折斷端的X線片觀察

圖2 3組大鼠骨痂骨組織（HE染色×40）

2.2 X線攝片觀察 1周時Ⅱ、Ⅲ組斷端可見少量骨痂形成；2周時Ⅰ組骨折線仍然清楚，骨折斷端未見明顯的骨痂形成。Ⅱ、Ⅲ組骨折線開始模糊，部分骨痂包繞在骨折斷端，但Ⅲ組的骨痂量要多于Ⅱ組（P＜0.05）；3周時Ⅰ組骨折線開始模糊，有少量骨痂形成，Ⅲ組周圍見大量骨痂包圍，甚至部分已經(jīng)骨化，而Ⅱ組骨折線消失，骨折周圍亦可見明顯骨性骨痂形成；2、3周Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅰ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅱ組與Ⅲ組間比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2～3、圖1。

表1 不同時間各組骨痂體積測量值結(jié)果（±s，mm3）

表1 不同時間各組骨痂體積測量值結(jié)果（±s，mm3）

▲：P＜0.05，與Ⅲ組比較；◆：P＜0.05，與Ⅱ組比較；▼：P＜0.05，與Ⅰ組比較。

病程組別 n 7d 14d 21dⅠ組 30 2.06±0.05▲ 10.04±0.11◆▲ 89.94±1.01◆▲Ⅱ組 30 2.70±0.22 38.55±1.50▲▼ 130.73±1.15▲▼Ⅲ組 30 3.79±0.34 56.41±3.31◆▼ 166.93±3.64◆▼

表2 骨折后2周各組X線片評分結(jié)果（n＝10）

2.3 HE染色結(jié)果 1周時Ⅰ組鏡下可見骨折端內(nèi)開始出現(xiàn)肉芽組織，新生毛細血管內(nèi)皮細胞、纖維母細胞等，其間夾雜有個別的軟骨細胞，成骨細胞及新生骨組織極少；Ⅱ、Ⅲ組肉芽組織、新生毛細血管、纖維母細胞逐步轉(zhuǎn)化為肥大的軟骨細胞，較Ⅰ組增多（P＜0.05）。2周時Ⅰ組鏡下可見骨折端肉芽組織繼續(xù)生長，少量纖維性骨痂生成；Ⅱ、Ⅲ組骨折斷端軟骨性骨痂增多，Ⅲ組骨折斷端局部甚至出現(xiàn)編織骨痂，新生骨小梁長入。3周時Ⅰ組骨折端有大量軟骨細胞，Ⅱ組可見大量骨性成分及新生骨小梁，Ⅲ組骨折處內(nèi)外骨痂改造、塑建完善，甚至部分模型的骨髓腔已經(jīng)形成；通過軟骨細胞觀察到骨折愈合情況，經(jīng)秩和檢驗2、3周Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅰ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)（P＜0.05）；Ⅱ組與Ⅲ組之間比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4～5、圖2。

表3 骨折后3周各組X線片評分結(jié)果（n＝10）

表4 骨折后2周各組軟骨細胞評分結(jié)果（n＝10）

表5 骨折后3周各組軟骨細胞評分結(jié)果（n＝10）

3 討 論

3.1 神經(jīng)因素與骨折愈合 骨折不愈合為臨床一種常見的并發(fā)癥，以往認為骨不連的發(fā)生和多種因素有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)骨不連的骨組織中少有或沒有神經(jīng)纖維長入，提示缺乏神經(jīng)控制對骨折后產(chǎn)生骨不連或延遲愈合等不良預(yù)后有一定影響。而在骨折修復(fù)愈合過程中，局部骨生長因子或細胞因子起重要作用［10－11］，包括有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍生因子（PDGF）、成纖維生長因子（FGF）、轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）、神經(jīng)生長因子（NGF）等。貝朝涌等［12］在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，NGF有促進骨折愈合的作用，并具有協(xié)同BMP－2誘導(dǎo)成骨的作用。但是有關(guān)神經(jīng)因素影響骨折愈合的具體機制目前還不明確，因此，如何在分子水平通過神經(jīng)因素的調(diào)節(jié)來治療骨不連及延遲愈合將是下一步臨床研究的重點和方向。

3.2 Neuritin與骨折愈合 作者在前期實驗中已證實，在腦外傷合并骨折的大鼠模型，其血清中Neuritin含量明顯升高，且局部注射Neuritin可明顯加速骨折愈合［7］。而且魏勇等［13］研究發(fā)現(xiàn)，腦外傷合并骨折患者血清中NGF、Neuritin表達明顯高于對照組，說明與骨折有密切的相關(guān)性，兩種因子可能在骨折愈合中共同起作用。本實驗研究采用Neuritin對SD大鼠骨折模型進行口服及局部注射，觀察骨折愈合情況。X線片評分結(jié)果顯示，術(shù)后2周時對照組與口服組、局部注射組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后3周時，差異更加明顯。這表明無論是口服還是局部注射Neuritin，大鼠骨折愈合速度均明顯加快；口服組與局部注射組之間比較，后者變化更加顯著，前者次之，這表明局部注射Neuritin在加速新生骨痂形成和成熟方面效果較口服更加顯著。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，口服組與局部注射組術(shù)后1～3周，軟骨細胞明顯增多，軟骨化骨的比率逐漸增高，并可見較成熟的小梁狀骨，而且在同一時間點上，口服組與局部注射組均比對照組變化明顯（P＜0.05），而前兩者比較，局部注射組變化又較口服組顯著（P＜0.05），這表明局部注射組在促進骨痂形成、成熟及加速骨折愈合方面明顯優(yōu)于其他組。作者認為，這可能是由于：（1）Neuritin注射于大鼠骨折斷端，局部藥物濃度高，從而對周圍神經(jīng)、血管及骨組織直接發(fā)揮作用；（2）口服Neuritin，在胃內(nèi)被消化分解一部分，最終經(jīng)吸收進入血液循環(huán)，到達骨折部位，這期間必然會影響其有效濃度，從而促進骨折愈合的作用也會較局部注射組減弱；（3）一般來說，藥物的生物利用度的關(guān)系為“肌肉＞皮下＞口服”，也支持上述結(jié)論。

3.3 Neuritin促進骨折愈合的可能機制 對骨折愈合中神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophins，NTFs）表達的研究表明，骨痂中有多種NTFs表達，包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF），NGF和神經(jīng)營養(yǎng)因子3，骨形成細胞有NGFs受體trkA和trkC的表達，提示NTFs涉及骨形成的調(diào)節(jié)。Neuritin作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一個新的成員，其可能是通過以下途徑促進骨折愈合的：（1）Neuritin促進神經(jīng)再生。研究顯示，Neuritin可以穩(wěn)定樹突棘上突觸的活性，促進突觸成熟［1］，對其蛋白的初步功能研究提示，重組體Neuritin促進神經(jīng)突起的生長和分支［14］，而無論是神經(jīng)活動的刺激還是神經(jīng)生長因子的直接作用都能誘導(dǎo)神經(jīng)突起的生長，提示Neuritin是神經(jīng)活動和各種神經(jīng)生長因子的共同下游因子，可促進神經(jīng)細胞樹突和軸突的生長和分支，在神經(jīng)再生和可塑性中起著重要作用，而神經(jīng)纖維的長入影響骨折愈合修復(fù)過程。（2）Neuritin與其他因子的協(xié)同作用。最近的研究顯示，Neuritin是NGF介導(dǎo)的神經(jīng)突起生長過程中必不可少的因子［2］，并與 NGF具有協(xié)同作用［15］，而大量實驗已證實，局部應(yīng)用NGF可明顯促進骨折愈合。提示Neuritin可能與其他神經(jīng)營養(yǎng)因子通過協(xié)同作用促進骨折愈合。（3）Neuritin與血管再生。在周圍神經(jīng)再生過程中，血供非常重要，它會影響神經(jīng)內(nèi)微環(huán)境的恒定，影響許旺細胞的增殖，從而影響軸索再生和髓鞘的再形成。外周組織中血管和神經(jīng)發(fā)育模式通常是協(xié)調(diào)一致的。Neuritin調(diào)節(jié)細胞結(jié)構(gòu)的功能同樣適用在非神經(jīng)元細胞，且作為一種新型血管生長因子在機體中起作用［5］。Neuritin還可促進血管生長，增強血管內(nèi)皮細胞的粘附和遷移能力，有利于新生的毛細血管的生長，改善骨折斷端的血流動力學(xué)，促進骨折的修復(fù)愈合。

綜上所述，Neuritin可加速骨折愈合，神經(jīng)因素對骨折愈合的調(diào)節(jié)作用是肯定的，然而，目前有關(guān)Neuritin在體內(nèi)的含量、分布還缺乏實驗證據(jù)，并且關(guān)于Neuritin與骨折愈合的相關(guān)報道甚少，因此在選擇Neuritin劑量的時候也沒有明確的標(biāo)準，導(dǎo)致本實驗，在選擇Neuritin的濃度時有一定局限性，尚未確定促進大鼠骨折愈合的最佳治療濃度，本研究通過SD大鼠動物實驗，意在初步驗證Neuritin對骨折愈合的作用，以及探討不同途徑給予Neuritin對骨折愈合療效的對比，為臨床用藥提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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