張秀梅 劉 超 劉 陽 肖建英 (遼寧醫(yī)學院生物化學教研室，遼寧 錦州 121000)

曲古抑菌素A(TSA)是一種氧肟酸類非競爭性可逆的組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑，也是四類HDAC抑制劑的代表藥物之一。近年研究表明，TSA可以納摩爾的濃度特異抑制哺乳動物組蛋白去乙?；?，使高度酰基化的組蛋白積累，激活基因表達、從而抑制多種腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞分化或凋亡，并且有細胞周期阻滯的作用〔1〕。值得注意的是，TSA的這些作用只針對腫瘤細胞，而對正常細胞無毒副作用，因此其抗腫瘤作用具有很好的選擇性。目前，TSA作為一種高效、低毒的組蛋白去乙?；敢种苿﹤涫荜P(guān)注。目前研究表明，TSA能夠誘導很多培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化細胞生長停滯、分化，包括白血病細胞、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌的細胞等〔2～4〕;本實驗采用人乳腺癌MCF-7細胞，通過觀察TSA對MCF-7細胞生長增殖、凋亡的影響及抑癌基因p21、p53表達水平，探討TSA抑制腫瘤細胞增殖及促進凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TSA、DMEM培養(yǎng)液、RT-PCR試劑盒(大連寶生物)、Trizol試劑(GIBCOBRL)兔抗人p21，p53多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)，Sunrise自動酶標檢測儀(瑞士TECAN公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與觀察 乳腺癌細胞株MCF-7購自上海生命科學院細胞和生物化學研究所。培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，飽和濕度、37℃、5%CO2的條件下進行傳代培養(yǎng)。當處于對數(shù)生長期時以105個/ml濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶，24 h后待細胞貼壁后給藥，使 TSA 終濃度分別為 50、100、200、400 nmol/L，對照組加入5 μl DMSO〔DMSO濃度小于0.1%(V/V)，此濃度對細胞生長無影響〕。

1.3 MTT法分析TSA對細胞增殖的影響 將96孔板每6孔設為一組，共設5組，第1組為對照組(培養(yǎng)液中含5 μl DMSO)。2～5組加入終濃度分別為 50、100、200、400 nmol/L 的TSA。將消化好的MCF-7細胞懸液，以5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，將于孵箱中培養(yǎng)24 h的細胞培養(yǎng)液吸出，按照上述分組分別施加處理因素，放入CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 48 h后取出培養(yǎng)板，加入新鮮培養(yǎng)液及50 μl MTT(1 mg/ml)孵育 4 h后，棄去培養(yǎng)液，然后加入 DMSO(100 μl/孔)，振蕩15 min，使沉淀物充分溶解。用自動酶標分析儀于490 nm波長下檢測光密度值。根據(jù)光密度值的大小來判斷活細胞數(shù)，存活率=加藥組A值/對照組A值×100%。

1.4 流式細胞儀檢測細胞的凋亡率 MCF-7細胞株接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后給藥，TSA終濃度分別為 50、100、200、400 nmol/L，對照組加入 5 μl DMSO。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)瓶，去除培養(yǎng)液，加入2 ml胰酶-EDTA消化液消化1 min左右，加入5 ml培養(yǎng)液，用吸管反復吹打成單細胞懸液，計數(shù)后收集細胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，最后將細胞收集于試管中，使每個管中的細胞為106個左右。參照試劑盒說明，將細胞重懸于200 μl中，加入10 μl AnnexinV-FITC和 5 μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液后上機檢測。

1.5 半定量RT-PCR檢測p21，p53基因mRNA的表達 采用Trizol一步法提取細胞總RNA。使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，在Taq酶的作用下進行PCR的擴增。p21的循環(huán)條件:94℃ 2 min、94℃ 變性 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min、30 個循環(huán)、72℃ 5 min;p53的循環(huán)條件:94℃ 2 min、94℃ 變性 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min、30 個循環(huán)、72℃ 5 min;β-actin 的循環(huán)條件:94℃ 2 min、94℃ 變性 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min、30 個循環(huán)、72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物10 μl進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，應用凝膠圖像分析管理系統(tǒng)進行灰度測量，mRNA的表達水平以每一樣品與其內(nèi)參β-actin灰度比值表示。PCR引物序列及擴增片段長度如下:p21上游引物:5'-AGCAGAGGAAGACCATGTGG-3';下游引物:5'-GGGTATGTACATGAGGAGGT-3'擴增片段長度:318 bp;p53上游引物:5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3';下游引物:5'-CTATGTCAAAAAGTGTTTCTGTCATC-3';擴增片段長度:292 bp。β-actin上游引物:5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3';下游引物:5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3';擴增片段長度661 bp。

1.6 Western印跡法檢測p21，p53蛋白的表達 用蛋白裂解液提取對數(shù)生長期細胞總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度，-20℃或-80℃保存?zhèn)溆?。電泳前，加入SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，之后用含5%BSA的TBST(pH7.4)將濾膜于室溫搖動溫育2 h進行封閉，封閉后的濾膜再分別與p21，p53抗體(稀釋比為1∶200)4℃溫育過夜。經(jīng)TBST洗滌后，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的IgG作為二抗(稀釋比為1∶5 000)室溫溫育2 h，洗膜后，使用ECL發(fā)光法顯色內(nèi)參采用β-actin。掃描X光片，計算機軟件處理，進行密度分析，計算灰度值。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多樣本均數(shù)檢驗采用方差分析的方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞存活率檢測結(jié)果 MCF-7細胞經(jīng)不同濃TSA作用后，各組細胞存活率隨著藥物濃度的升高而降低(P＜0.01)，且呈劑量依賴性。見表1。

2.2 細胞凋亡率檢測結(jié)果 MCF-7細胞株經(jīng)TSA作用后，各濃度組細胞凋亡圖及凋亡率見表1和圖1，各濃度組凋亡率隨著TSA濃度的升高而升高(P＜0.01)。

2.3 TSA對MCF-7細胞p21、p53基因mRNA的表達的影響與對照組相比，TSA組在一定濃度范圍內(nèi)(50～400 nmol/L)隨著藥物濃度的增加，p21 mRNA表達水平逐漸增加并成劑量依賴性;而p53的表達未見明顯變化。見表2、圖2。

表1 TSA對MCF-7細胞存活率和凋亡率的影響(± s，n=6，%)

表1 TSA對MCF-7細胞存活率和凋亡率的影響(± s，n=6，%)

與對照組比較:1)P＜0.01;與前一組比較:2)P＜0.01;下表同

TSA濃度(nmol/L)存活率 凋亡率0(對照組)0.931 6±0.17 2.81±0.15 50 0.808 4±0.341) 3.02±0.221)100 0.704 3±0.251)2) 12.74±0.902)200 0.614 2±0.111)2) 20.32±0.762)400 0.501 8±0.211)2) 44.32±0.582)

圖1 Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞散點圖

表2 TSA對p21、p53mRNA的表達水平的影響(± s，n=3)

表2 TSA對p21、p53mRNA的表達水平的影響(± s，n=3)

TSA 濃度(nmol/L) p53/β-actin p21/β-actin 0(對照組)0.121±0.078 0.053±0.056 50 0.135±0.057 0.154±0.0261)100 0.148±0.065 0.297±0.0332)200 0.135±0.047 0.404±0.0422)400 0.143±0.076 0.412±0.0531)

表3 TSA對p21、p53蛋白的表達水平的影響(± s，n=3)

表3 TSA對p21、p53蛋白的表達水平的影響(± s，n=3)

TSA 濃度(nmol/L) p53/β-actin p21/β-actin 0(對照組)0.156±0.023 0.126±0.035 50 0.173±0.051 0.254±0.0471)2)100 0.145±0.034 0.376±0.0391)2)200 0.165±0.047 0.575±0.0531)2)400 0.138±0.054 0.725±0.0691)2)

2.4 TSA對MCF-7細胞p53、p21蛋白表達的影響 與對照組相比，TSA組在一定濃度范圍內(nèi)(50～400 nmol/L)隨著藥物濃度的增加，p21的蛋白表達逐漸增加，呈劑量依賴性，而p53的蛋白表達未見明顯變化，見表3、圖3。

3 討論

圖2 TSA對p21、p53 mRNA表達的影響

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細胞增殖的失控、分化障礙及凋亡受阻密切相關(guān)，細胞增殖是通過細胞周期來實現(xiàn)的，阻滯細胞周期即能起到阻止細胞增殖的作用;細胞凋亡的受阻增加了細胞突變的概率，進而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。

p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，野生型的p53在維持細胞正常生長，抑制惡性增殖中起著重要作用，p53時刻監(jiān)控著細胞染色體DNA的完整性，一旦細胞染色體DNA遭到損害，p53蛋白與基因的DNA相應部位結(jié)合，起特殊轉(zhuǎn)錄因子的作用，活化p21基因的轉(zhuǎn)錄，使細胞停滯于G1期，參與DNA的復制與修復。如果修復失敗，p53蛋白即啟動凋亡過程誘導細胞自殺，阻止有癌變傾向突變細胞的生成，從而阻止細胞惡變〔5〕。

本研究與文獻報道相一致〔6〕。本實驗提示，TSA抑制細胞增殖可能與其維持p53的穩(wěn)定表達有關(guān)，p53蛋白很不穩(wěn)定，在細胞中極易被降解，曾有文獻報道〔7〕TSA能夠穩(wěn)定p53的乙酰化水平，使p53不被蛋白酶體降解，從而促進其下游因子p21基因的轉(zhuǎn)錄，進而提高p21的表達，支持本實驗結(jié)果。p21位于p53的下游，是細胞周期的重要的抑制因子，p21可與細胞周期依賴性蛋白激酶結(jié)合，從而阻止細胞進入S期，抑制細胞增殖。TSA促進凋亡的機制也可能與其穩(wěn)定p53的表達有關(guān)。曾有文獻報道〔8〕，TSA能夠促進C6膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。Boulaiz等〔9〕也曾報道在MCF-7細胞中g(shù)ef基因的表達誘導凋亡是通過p53途徑實現(xiàn)的。

綜上，TSA抑制MCF-7細胞增殖、促進凋亡的機制可能是通過穩(wěn)定p53的表達，從而促進p21基因的表達，進而抑制細胞周期依賴性蛋白激酶的活性，從而抑制細胞增殖，關(guān)于TSA促進MCF-7細胞凋亡的機制正在進一步研究之中。

圖3 Western印跡法檢測細胞周期相關(guān)蛋白表達

1 Pan LN，Lu J，Huang B.HDAC inhibitors:a potential new category of anti-tumor agents〔J〕.Cell Mol Immunol，2007;4(5):337-43.

2 Fortson WS，Kayarthodi S，F(xiàn)ujimura Y，et al.Histone deacetylase inhibitors，valproic acid and trichostatin-A induce apoptosis and affect acetylation status of p53 in ERG-positive prostate cancer cells〔J〕.Int J Oncol，2011;39(1):111-9.

3 Xiong H，Du W，Zhang YJ，et al.Trichostatin A，a histone deacetylase inhibitor，suppresses JAK2/STAT3 signaling via inducing the promoter-associated histone acetylation of SOCS1 and SOCS3 in human colorectal cancer cells〔J〕.Mol Carcinog，2012;51(2):174-84.

4 Puppin C，Passon N，F(xiàn)ranzoni A，et al.Histone deacetylase inhibitors control the transcription and alternative splicing of prohibitin in thyroid tumor cells〔J〕.Oncol Rep，2011;25(2):393-7.

5 查錫良.生物化學〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:476.

6 王 新，肖建英，張秀梅，等.TSA對甲狀腺鱗癌SW579細胞株生長增殖的影響〔J〕.遼寧醫(yī)學院學報，2008;29(1):17-9.

7 Roy S，Packman K，Jeffrey R，et al.Histone deacetylase inhibitors differentially stabilize acetylated p53 and induce cell cycle arrest or apoptosis in prostate cancer cells〔J〕.Cell Death Different，2005;12:482-91.

8 Hsu YF，Sheu JR，Hsiao G，et al.p53 in trichostatin A induced C6 glioma cell death〔J〕.Biochim Biophys Acta，2011;1810(5):504-13.

9 Boulaiz H，Alvarez PJ，Prados J，et al.Gef gene expression in MCF-7 breast cancer cells is associated with a better prognosis and induction of apoptosis by p53-mediated signaling pathway〔J〕.Int J Mol Sci，2011;12(11):7445-58.