張海燕 劉忠錦 陳志偉 (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 6006)

阿爾茨海默病(AD)占癡呆總數(shù)的50% ～60%〔1〕。其特征是海馬、額葉、顳葉等腦區(qū)出現(xiàn)老年斑(SP)和纏結(jié)一起神經(jīng)元及大量突觸連接的消失。臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶障礙，智力衰減，常伴有人格劣化。AD的治療現(xiàn)代主要是延緩AD的發(fā)展和增強(qiáng)神經(jīng)元的功能恢復(fù)能力，來進(jìn)一步改善癥狀。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠海馬的蛋白激酶C(PKC)、β-淀粉樣蛋白(Aβ)測定，旨在證明電針能改善AD大鼠的記憶能力，并進(jìn)一步探求治療AD的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD雄性大鼠60只，體重180～200 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(批號(hào):2010002)。在實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定條件下飼養(yǎng)1 w。鏈脲佐菌素(STZ，Introvengen公司 批號(hào):I5025)、氫溴酸加蘭他敏(陜西森弗生物技術(shù)有限公司批號(hào):100050-197801)、Aβ、PKC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司批號(hào):200810)、腦立體定位儀(NARISHIGE SN-2型)、Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、G6805-II型電針治療儀(上海醫(yī)療器械廠)、華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.2 動(dòng)物造模 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀。常規(guī)消毒皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜。微量注射器每側(cè)側(cè)腦室各注射STZ10 μl，注射前將STZ溶于生理鹽水，濃度為10%。參照《大鼠腦立體定位圖譜》〔2〕:前囟1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm，腦表面下3.5 mm，用微量注射器將STZ在2 min內(nèi)緩慢注入，留針5 min，充分浸潤局部組織，緩慢拔出微量注射器。第3天重復(fù)注射，劑量同前，正常組不予處置，模型對(duì)照組操作同前。

1.3 動(dòng)物分組 所有大鼠經(jīng)第1天的水迷宮試驗(yàn)，排除先天愚笨者(不會(huì)游泳及原地打轉(zhuǎn)者);再從剩余60只大鼠中隨機(jī)分5組，每組12只。全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用相同的飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)過程中所使用的器皿均為非鋁制品。正常組:給予常規(guī)飼養(yǎng)。模型對(duì)照組:每側(cè)側(cè)腦室各注射生理鹽水10 μl。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。模型組:造模后常規(guī)飼養(yǎng)。電針組:第2次水迷宮測試結(jié)束24 h后，電針組用0.35 mm×25 mm毫針針刺“百會(huì)”穴，斜刺約0.5寸，“涌泉”直刺0.3寸。“百會(huì)”穴、“涌泉”穴連接電針治療儀，選擇斷續(xù)波，頻率為20 Hz，電壓為2 V，強(qiáng)度以肢體輕微抖動(dòng)為度，用0.35 mm×25 mm毫針針刺大鼠雙側(cè)“太溪”穴，直刺進(jìn)針3 mm，雙側(cè)“腎俞”穴，直刺進(jìn)針5 mm，雙側(cè)“足三里”穴，直刺進(jìn)針4 mm間歇5 min捻轉(zhuǎn)一次，平補(bǔ)平瀉。每日1次，時(shí)間30 min。7 d為一療程，間歇1 d，治療3個(gè)療程后進(jìn)行行為學(xué)測試。西藥組:氫溴酸加蘭他敏每日0.5～1 mg/kg體重。

1.4 取材 治療結(jié)束后第2天，每組隨機(jī)選取10只大鼠大鼠用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射，麻醉后立即開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳，快速灌注0.85%生理鹽水，至肝臟變白改灌注液為4%多聚甲醛，灌注時(shí)間約30 min，見大鼠尾巴、四肢僵硬視為滿意，取腦并分離海馬，放入4%的多聚甲醛溶液中固定過夜，之后進(jìn)行石蠟包埋，組織切片，HE染色，免疫組織化學(xué)染色。PKC、Aβ免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕黃色點(diǎn)狀顆粒，主要分布在胞質(zhì)。采集免疫組化染色圖像，用Imagepro-Plus6.0分析軟件進(jìn)行圖像分析，每張切片區(qū)4個(gè)視野測定海馬組織中陽性產(chǎn)物的積分光密度值(IOD)和陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 治療后各組海馬區(qū)PKC蛋白表達(dá)比較 正常組、模型對(duì)照組PKC蛋白有較高表達(dá)，模型組PKC蛋白表達(dá)水平顯著降低，治療后西藥組、電針組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，見表1，圖1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)PKC蛋白表達(dá)(DAB，×400)

2.2 治療后各組海馬區(qū)Aβ蛋白表達(dá)比較 正常組、模型對(duì)照組Aβ蛋白有較低表達(dá)，模型組Aβ蛋白表達(dá)水平顯著升高，治療后西藥組、電針組較模型組表達(dá)減少(P＜0.05)。見表2。

表1 各組海馬PKC蛋白表達(dá)(± s，n=10)

表1 各組海馬PKC蛋白表達(dá)(± s，n=10)

與模型組比:1)P＜0.05，下表同

組別 積分光密度值 表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/高倍視野)正常組 0.324±0.0621) 31.85±14.631)模型對(duì)照組 0.329±0.0651) 30.72±15.191)模型組 0.203±0.071 17.25±3.26西藥組 0.304±0.0591) 27.31±10.241)電針組 0.301±0.0641) 26.47±11.631)

表2 各組海馬Aβ蛋白表達(dá)(± s，n=10)

表2 各組海馬Aβ蛋白表達(dá)(± s，n=10)

組別 積分光密度值 表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/高倍視野)正常組 0.168±0.0071) 10.87±3.151)模型對(duì)照組 0.165±0.0041) 11.09±3.281)模型組 0.239±0.012 25.31±2.46西藥組 0.179±0.0061) 20.52±2.631)電針組 0.181±0.0081) 21.94±2.701)

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎藏精，生髓，通于腦，“腦為位髓?！保澳X為元神之府”髓海充實(shí)，則神清氣朗，耳聰目明。AD常由年老體衰，腎精不足、髓海失養(yǎng)，加之痰濁瘀血阻滯腦竅，神明被蒙，導(dǎo)致記憶衰退，反應(yīng)呆鈍等癥。歷代醫(yī)家已意識(shí)到“腎虛血瘀、濁毒內(nèi)生、損傷腦髓”是AD發(fā)病的重要機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)針刺治療的原則是“補(bǔ)腎活血、化痰通絡(luò)、醒神開竅”。在上述治療原則的指導(dǎo)下選出“百會(huì)”、“大椎”、“太溪”、“腎俞”、“足三里”組成針灸治療處方。

AD的病理學(xué)特征是大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)、SP形成以及神經(jīng)元缺失，其中SP主要成分為Aβ，而NFT主要成分為異常過度磷酸化的 Tau蛋白形成。Aβ在AD的發(fā)病機(jī)制中具有核心的作用，是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。PKC對(duì)AD的Aβ和Tau蛋白形成起重要作用。PI信號(hào)系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)β-淀粉樣蛋白前體(APP)的正常降解過程，水解所產(chǎn)生的DAG使PKC激活，激活的PKC從而使Aβ生成減少。Cordey等〔3〕研究證明經(jīng)典的PKC亞型能夠阻止Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡。另一方面，F(xiàn)orlenza等〔4〕研究指出，PKC抑制糖原合成激酶-3β(GSK-3β)磷酸化Tau蛋白的作用，從而可減少Tau蛋白磷酸化。邢偉等〔5〕通過研究發(fā)現(xiàn)慢性鋁暴露影響大鼠海馬PKC mRNA和PKC蛋白表達(dá)，使PKC活性降低，導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)長時(shí)程形成，從而影響學(xué)習(xí)記憶功能。該研究表明，PKC活性可以影響神經(jīng)細(xì)胞的學(xué)習(xí)記憶功能。PKC與突觸可塑性及長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP)的形成密切相關(guān)。PKC的激活是LTP產(chǎn)生的重要條件之一。針刺通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能，抗氧化以及改善突觸形態(tài)可塑性及LTP，來直接或間接提高AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔6～8〕。

綜上所述，電針治療可降低Aβ在腦內(nèi)的表達(dá)，激活PKC表達(dá)，在一定程度上阻止神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過程;電針可引起激活PKC抑制Aβ和 Tau蛋白形成，可間接減少NFT、SP形成，從而起到保護(hù)腦細(xì)胞、延緩衰老的作用。這可能是針刺能有效地防治老年性癡呆的作用機(jī)制之一。

1 Blennow K，de LM，Zetterberg H.Alzhemier’s disease〔J〕.Lancet，2006;368(9533):387-403.

2 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，1994:20-40.

3 Cordey M，Pike C.Conventional protein kinase C isoforms mediate neuroprotection induced by phorbol ester and estrogen〔J〕.Neurochemisry，2006;96(1):204-17.

4 Forlenza OV，Spink JM，Dayanandan R，et al.Muscarinic agonists reduce tau phosphorylation in non-neuronal cells via GSK-3beta inhibition and in neurons〔J〕.J Neural Transm，2000;107(10):1201-12.

5 邢 偉，王 彪，文 濤，等.鋁暴露對(duì)大鼠海馬蛋白激酶Cr亞型影響〔J〕.中國公共衛(wèi)生，2007;23(3):305-7.

6 劉智斌，牛文民，楊曉航，等.嗅三針對(duì)老年癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬膽堿乙?；?、乙酰膽堿酯酶活性的影響〔J〕.針刺研究，2009;34(1):48-51.

7 彭 靜，曾 芳，何宇恒，等.電針對(duì)SAMP 8小鼠海馬線粒體作用的研究〔J〕.針刺研究，2007;32(6):364-7.

8 唐 勇，尹海燕，曾 芳，等.針刺原位誘導(dǎo)阿爾茨海默病海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的思考〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2005;3(5):351-3.