郭 影 郭 麗 張陳彥 狄建敏 (河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊 05005)

骨保護(hù)蛋白(OPG)/RANKL/核因子 κB受體活化因子(RANK)系統(tǒng)是近年來發(fā)現(xiàn)的在破骨細(xì)胞分化過程中的一個(gè)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，作為雌激素發(fā)揮抗骨吸收作用的中間環(huán)節(jié)，提出成骨細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞分化成熟的機(jī)制，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其中核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞發(fā)育和蛋白酶合成。NF-κB是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞產(chǎn)生中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，抑制該因子或抑制其介導(dǎo)的信號(hào)通路中其他細(xì)胞因子的表達(dá)可減少甚至抑制破骨細(xì)胞的生成。本研究以去卵巢大鼠建立PMOP模型，觀察各組大鼠體重、股骨骨密度(BMD)及骨組織學(xué)變化，檢測各組大鼠骨組織中NF-κB p65，研究NF-κB表達(dá)異常與PMOP發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和PMOP動(dòng)物模型制備 3月齡成年雌性Sprague/Dawley大鼠30只，隨機(jī)分為兩組，每組15只:①假手術(shù)(Sham)組、②卵巢切除(OVX)組。將大鼠以10%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，無菌條件下，經(jīng)腰背部正中縱形切口進(jìn)入腹腔背側(cè)，將OVX組大鼠切除雙側(cè)卵巢，Sham組大鼠切除雙側(cè)卵巢下方少許脂肪組織，重量約與卵巢相同。術(shù)后正常攝食水，實(shí)驗(yàn)共12 w。

1.2 雙能X線吸收法確立PMOP動(dòng)物模型 于去勢后12 w，分別取各組大鼠置于Osteocore3型雙能X線骨密儀上，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中心動(dòng)物軟件，測量每只大鼠雙側(cè)股骨及腰椎BMD，取平均值。BMD值用g/cm2表示。

1.3 蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)染色 動(dòng)物處死后，立即無菌操作取左側(cè)股骨下段，進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色及觀察。

1.4 結(jié)果判定與圖像分析、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所測數(shù)值均以±s表示，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene法，各組間變量比較采用完全隨機(jī)的單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨BMD比較 與Sham組〔(0.209±0.010 5)g/cm2〕相比，OVX組 BMD明顯下降〔(0.181±0.008 5)g/cm2〕(P＜0.05)。

2.2 骨組織學(xué)觀察 與Sham組大鼠比較，OVX組大鼠骨皮質(zhì)變薄，骨小梁稀疏或斷裂，骨髓腔增寬。見圖1。

圖1 兩組骨組織學(xué)觀察(HE)

2.3 免疫組織化學(xué)染色觀察及結(jié)果 NF-κB p65主要位于骨小梁周邊成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞中，骨髓基質(zhì)細(xì)胞亦呈陽性染色。OVX組骨小梁周邊NF-κB p65陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于Sham組，且表達(dá)強(qiáng)于Sham組。見圖2。

與Sham組(105.59±4.938)相比，OVX組大鼠骨組織中NF-κB p65陽性細(xì)胞染色灰度值(150.506±5.510)增高(P＜0.05)。

圖2 免疫組織化學(xué)染色觀察兩組骨組織NF-κB p65 陽性細(xì)胞(DAB)

2.4 相關(guān)性分析 與Sham組相比，OVX組NF-κB p65表達(dá)與BMD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.765，P＜0.05)。

3 討論

切除雙側(cè)卵巢是復(fù)制PMOP模型的經(jīng)典方法，3～9月齡為復(fù)制該模型大鼠的合適鼠齡〔1〕。本研究中選取3月齡成年雌性S/D大鼠為研究對(duì)象，BMD測定及組織學(xué)觀察顯示，OVX組大鼠較Sham組相比，BMD明顯下降，骨皮質(zhì)變薄，骨髓腔擴(kuò)大，骨小梁稀疏或斷裂，骨小梁寬度變窄、間距變寬，表明PMOP模型建立。

骨組織中NF-κB家族是控制破骨細(xì)胞生成和激活的重要因子，主要位于成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞中。動(dòng)物研究表明NF-κB p50/p52基因敲除的小鼠，表現(xiàn)為骨骼石化癥〔2〕。其原因可能是在RANKL及其他破骨細(xì)胞刺激因子作用下，RANK刺激破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為抗酒石酸性磷酸酯酶陽性(TRAP+)破骨細(xì)胞的途徑中，NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻造成〔3〕。

研究表明雌激素可能通過以下幾種途徑抑制NF-κB的表達(dá):(1)雌激素可通過阻斷IκB激酶(IKK)的活化，減少IκB的降解，從而抑制 NF-κB 的活化〔4〕;(2)雌激素受體與 NF-κB 之間有相互拮抗作用，雌激素可以通過上調(diào)受體途徑抑制NF-κB的活化〔5〕;(3)雌激素通過抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子，進(jìn)而抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的NF-κB活化〔6〕。PMOP中由于雌激素的減少，使之對(duì)NF-κB的抑制作用減低，NF-κB在骨組織中表達(dá)異常增加，導(dǎo)致受其調(diào)節(jié)的靶基因表達(dá)異常增多，如破骨細(xì)胞刺激因子白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及TNF-α等，最終造成絕經(jīng)后的骨丟失。

本試驗(yàn)與上述研究結(jié)果一致，結(jié)果顯示:(1)免疫組織化學(xué)觀察，NF-κB p65陽性信號(hào)主要位于骨小梁周邊成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞中，OVX組骨小梁周邊陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于Sham組。(2)骨組織中NF-κB p65陽性細(xì)胞染色灰度值測定結(jié)果，OVX組骨組織中NF-κB p65明顯高于Sham組。(3)NF-κB p65與BMD相關(guān)性分析結(jié)果顯示，與Sham組相比，OVX組NF-κB p65表達(dá)與BMD呈負(fù)相關(guān)?？梢姡殡SNF-κB p65在兩組大鼠骨組織中表達(dá)增高，BMD有下降的趨勢，而且在OVX組中NF-κB p65表達(dá)與BMD呈負(fù)相關(guān)，表明NF-κB在PMOP的發(fā)病機(jī)制中可能起到重要作用。

1 Shiraishi A，Takeda S，Masaki T，et al.Alfacalcidol inhibits bone resorption and stimulates formation in an ovariectomized rat model of osteoporosis:distinct actions from estrogen〔J〕.J Bone Miner Res，2000;15(4):770-9.

2 Iotsova V，Caamano J，Loy J，et al.Osteopetrosis in mice lacking NF-κB1 and NF-κB2〔J〕.Nat Med，1997;3(11):1285-9.

3 Soysa NS，Alles N.NF-kappa B functions in osteoclasts〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2009;378(1):1-5.

4 Sun WH，Keller ET，Stebler BS，et al.Estrogen inhibits phorbol ester-induced I kappa B alpha transcription and protein degradation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1998;244(3):691-5.

5 Mckay LI，Cidlowski JA.Cross-talk between nuclear factor-kappa B and the steroid hormone receptors:mechanisms of mutual antagonism〔J〕.Mol Endocrinol，1998;12(1):45-6.

6 Yamaguchi M，Weitzmann MN.The estrogen 17 beta-estradiol and phytoestrogen genistein mediate differential effects on osteoblastic NF-kappaB activity〔J〕.Int J Mol Med，2009;23(2):297-30.