何 寧 朱毅林 車國良

長沙市八醫(yī)院骨科，湖南長沙 410002

1 研究背景

某些腫瘤細胞不單對原使用的藥物產生耐藥，同時對與之結構和作用機制完全不同的藥物也會產生交叉耐藥現(xiàn)象，這一現(xiàn)象被稱為多藥耐藥（multidrugre sistance，MDR）[1]。國內外許多研究證實了腫瘤多藥耐藥是由P糖蛋白（P-gp170）介導，P-gp170為細胞膜表面的一種分子量約170KD的糖蛋白，細胞的抗藥性是通過P170蛋白的作用而實現(xiàn)的[1]。因P170蛋白的藥物外排泵作用，降低了細胞內藥物的有效濃度，使腫瘤細胞逃逸了化療藥物的細胞毒作用，表現(xiàn)出抗藥性。近年發(fā)現(xiàn)中藥單體川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）具有鈣離子阻滯作用，而鈣離子阻滯劑多有化療增敏，逆轉腫瘤細胞多藥耐藥作用。本實驗采用體外進行骨肉瘤耐藥細胞（MG-63/ADM）的培養(yǎng)，觀察川芎嗪及聯(lián)用阿霉素在下調骨肉瘤耐藥細胞（MG-63/ADM）中P-170蛋白的表達的作用。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 細胞系 人骨肉瘤（MG-63）細胞以及骨肉瘤（MG-63）耐藥細胞系購于中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心。

2.1.2 主要試劑和儀器 試劑：磷酸川芎嗪、阿霉素粉針、鏈霉素粉針和青霉素粉針、RPMI-1640液體培養(yǎng)基、胰蛋白酶、MTT粉FITC標記鼠抗人P-gp抗體。儀器：IX70倒置顯微鏡、Galaxys二氧化碳培養(yǎng)箱、LXJ-Ⅱ低速離心機、Centrifuge 5415高速離心機、電熱恒溫干燥箱、-20℃、4℃冰箱、超聲波破碎儀、流式細胞儀FACSCalibur。

2.2 方法

2.2.1 細胞培養(yǎng)條件 人骨肉瘤（MG-630細胞以及骨肉瘤（MG-63）耐藥細胞在37℃，5%CO2飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 MTT法測定骨肉瘤耐藥細胞的耐藥性 本實驗MTT法是參照Scheltema的MTT法以及MTT法的影響因素的相關文獻[2-3]，實驗具體步驟如下：①取對數(shù)生長MG-63細胞，用0.25%胰酶分散細胞，吹打成細胞懸液，取適量細胞懸液染色后上細胞計數(shù)板進行記數(shù)，調整細胞懸液的濃度為3×104/mL，每孔180 μL細胞懸液植入96孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃，100%濕度、含5%CO2實驗條件的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。②待96孔板內細胞貼壁后，分別設有7組：對照組（1組不加任何藥物），實驗組（2～7組）各組內藥物組合以及藥物濃度如表1所示。

表1 MTT實驗各組內藥物濃度

逆轉耐藥骨肉瘤細胞的川芎嗪的濃度的確定是根據(jù)相關文獻，用 MTT法確定該藥物對細胞生長率＞95%的藥物濃度為非細胞毒性劑量[1]。用 MTT法檢測川芎嗪對MG-63/ADM耐藥細胞生長率＞95%的藥物濃度為20 ng/mL以下。

③培養(yǎng)4～6 h后，給96孔板每孔加入MTT20μl（5 mg/mL），至MTT沉淀完全溶解，上酶標儀檢測其分光光度值，測定570nm波長下吸光度值（OD值）取3孔OD值的平均數(shù)，實驗重復3次。

用統(tǒng)計軟件13.0計算出各組藥物對細胞的相應的IC50值（藥物殺傷細胞的50%的藥物劑量）。用下式計算耐藥細胞的耐藥倍數(shù)[4]：耐藥倍數(shù)=培養(yǎng)后的耐藥細胞IC50值/培養(yǎng)前的細胞IC50值

2.2.3 流式細胞儀測定細胞P糖蛋白（P-gp）的表達 分別用含有2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL和20 ng/mL的川芎嗪的RPMI-1640細胞液體培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63/ADM耐藥細胞72 h后，以0.25%的胰酶消化后收集1×106個細胞。上流式細胞儀檢測8～10×103個細胞，測定P糖蛋白（P-gp）的表達陽性率。每組檢測3個平行標本，最終結果取三個結果的均值。本實驗對照組為加藥培養(yǎng)前的原始細胞，同樣收集1×106個細胞，按照上述過程處理，但不用抗體標記。

2.3 統(tǒng)計學分析方法

運用SPSS 13.0軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，主要包括：單因素方差分析、LSD-t檢驗、χ2檢驗等。均取P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 MG-63/ADM耐藥細胞培養(yǎng)結果

MG-63/ADM耐藥細胞可以在含0.29 ng/mL阿霉素（ADM）的1640液體培養(yǎng)基中生長。誘導培養(yǎng)的MG-63/ADM耐藥細胞的耐藥倍數(shù)是11.62。流式細胞儀測定MG-63/ADM耐藥細胞的P糖蛋白（P-gp）表達是強陽性，表達率為69.86%。兩種細胞相關參數(shù)比較見表2。

表2 不耐藥MG-63和耐藥細胞相關參數(shù)的比較

3.2 流式細胞檢測骨肉瘤細胞的P170表達的結果

①不耐藥骨肉瘤細胞P170表達（均數(shù)為10.55%）；②耐藥骨肉瘤細胞P170表達（均數(shù)為69.86%）；③用2.5 ng/mL的川芎嗪處理耐藥細胞后的P170表達（均數(shù)為60.26%）；④用5 ng/mL的川芎嗪處理耐藥細胞后的P170表達（均數(shù)為55.07%）；⑤用10 ng/mL的川芎嗪處理耐藥細胞后的P170表達（均數(shù)為46.85%）；⑥用20 ng/mL的川芎嗪處理耐藥細胞后的P170表達（均數(shù)為36.2%）。

流式細胞儀檢測經過或未經過TMP處理的骨肉瘤耐藥細胞P170蛋白的表達率結果見以上。不耐藥的骨肉瘤細胞P170蛋白的表達率為10.55%；而耐藥的骨肉瘤細胞P170蛋白的表達率高達69.86%。

統(tǒng)計學分析，實驗組和對照組之間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），各組P170表達率經過兩兩比較，差異均有顯著的統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01）。本實驗結果說明TMP對骨肉瘤耐藥細胞的P170表達具有明顯的下調作用。

4 討論

許多腫瘤都有發(fā)生多藥耐藥的現(xiàn)象，雖然MDR的確切發(fā)生機制尚未完全闡明，但研究證實：P-170蛋白的過度表達是其主要機制之一[5]。因此，研制新的化療增效劑，提高腫瘤對化療的敏感性，特別是國外研究多藥耐藥的逆轉劑或是耐藥調節(jié)劑[6]，提高骨肉瘤腫瘤細胞對化療藥物的反應成了進一步改善骨肉瘤患者生存率的重要途徑。

本實驗非細胞毒濃度的川芎嗪與阿霉素聯(lián)用在下調骨肉瘤耐藥細胞（MG-63/ADM）的P-170蛋白表達的程度，從而探討其逆轉骨肉瘤耐藥細胞耐藥性的機制。

4.1 培養(yǎng)的骨肉瘤耐藥細胞的耐藥性

本實驗中的MG-63/ADM耐藥細胞的耐藥倍數(shù)是11.62，同時流式細胞儀測定MG-63/ADM耐藥細胞的P170（P-gp）表達是強陽性。應證了骨肉瘤耐藥性和骨肉瘤的P170表達具有明顯的相關性。

4.2 TMP對骨肉瘤耐藥細胞的P170表達的下調作用

當川芎嗪的濃度從2.5 ng/mL，增加到5、10、20 ng/mL時，耐藥細胞的P170相應地表達率為60.26%、55.07%、46.85%、36.2%。統(tǒng)計學分析表明，經過川芎嗪處理的細胞組和未經過川芎嗪處理的細胞組之間有統(tǒng)計學差異（P ＜ 0.05）。實驗結果說明非細胞毒濃度的TMP對骨肉瘤耐藥細胞的P170表達具有一定下調作用。

4.3 TMP對骨肉瘤耐藥細胞的耐藥性的逆轉作用及其機制

本實驗結果表明TMP對骨肉瘤耐藥細胞的P170表達具有一定下調作用；由此可見，TMP對骨肉瘤耐藥細胞的耐藥性有部分逆轉的作用，其機制之一是TMP可以下調腫瘤細胞膜上的P170蛋白的表達從而可能減少P170蛋白對ADM的外排作用，進而達到更好地殺傷骨肉瘤耐藥細胞的效果；是否還有其它機制存在，還需要進一步研究。

總之，川芎嗪具有下調骨肉瘤MG-63/ADM耐藥細胞的P-170蛋白的表達從而降低骨肉瘤細胞耐藥性的作用。

[1] Min YD，Yang MC，Lee KH，et al.Protoberberine alkaloids and their reversal activity of P-gp expressed multidrug resistance（MDR）from the rhizome of Coptis japonica Makino[J].Arch Pharm Res，2006，29（9）：757-761.

[2] Loo T W，Bartlett MC，Clarke DM.Drug binding in human P-glycoprotein causes conformational changes in both nucleotide-binding domains[J].J Biol Che m，2003，278（50）：1575-1578.

[3] A WGATI QA.Regulation of ion channels by ABC transporters that secrete ATP[J].Science，1995，269（l）：805.

[4] Fuji H，Tanigawa N，Muraoda R，et al.Detection of P-g1ycoprotein by flow cytometry[J].Anticancer Res，1993，13：2171.

[5] Homicek FJ，Gebhardt Mc，Wolfe MW，et al.P-glycoprotein levels predict poor outcome in patients with osteosarcoma[J].J Clin Orthop，2000，373（1）：11-l7.

[6] Scotlandi K，Serra M，Nicoletti G，et al.Cancer Res，1996，56（10）：2434-2439.