李 淼，侯強(qiáng)紅，蔡絲絲，李 奔，李林波，侯利蘭

（1．懷化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 懷化418000；2．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128）

雞蛔蟲屬于蛔目禽蛔科禽蛔屬，是雞體內(nèi)最大型的一種線蟲，主要寄生于腸道內(nèi)而引起的一種線蟲病。雞蛔蟲對(duì)雞的危害很大，尤其是雛雞，大量成蟲寄生在小腸黏膜時(shí)，則會(huì)引起腸道堵塞、破裂以及腹膜炎，嚴(yán)重感染時(shí)可引起宿主死亡。雞蛔蟲病的感染呈世界性分布，主要分布在歐洲、亞洲等地，而在亞洲地區(qū)，則以中國(guó)部分地區(qū)的感染情況較為突出；其他亞洲國(guó)家也有感染的病例。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子遺傳學(xué)技術(shù)在寄生蟲遺傳變異及分類學(xué)研究上的應(yīng)用日益發(fā)展，它主要是從DNA水平上研究寄生蟲分類學(xué)中的一些問題。在寄生蟲種群中，遺傳變異十分普遍。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者利用此類方法來(lái)研究雞蛔蟲的遺傳變異及分類問題［1－3］。因此，精確分析寄生蟲的遺傳變異對(duì)研究寄生蟲的分類、鑒定及寄生蟲的遺傳結(jié)構(gòu)均具有重要意義。

線粒體基因組具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、缺少重組、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，特別適合作為遺傳學(xué)研究的標(biāo)記［4－6］。自1962年 Nass［7］等發(fā)現(xiàn) mtDNA 以來(lái)，被廣泛用于系統(tǒng)進(jìn)化分析、比較和功能基因組研究等方面［8］。有鑒于此，本試驗(yàn)以從湖南等地的雞只所分離的雞蛔蟲作為研究對(duì)象，PCR擴(kuò)增其pcox2and pnad4并進(jìn)行序列分析，為今后雞蛔蟲的分類、鑒別診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查，以及本病的防治等更深入的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 蟲體樣品 本試驗(yàn)研究的12株雞蛔蟲樣品分別采自長(zhǎng)沙馬王堆菜市場(chǎng)（MWD1－MWD3）、長(zhǎng)沙望城菜市場(chǎng)（WC1－WC3）、長(zhǎng)沙瀏陽(yáng)菜市場(chǎng)（LY1－LY3）、長(zhǎng)沙寧鄉(xiāng)菜市場(chǎng)（NX1－NX3）。

1．2 主要試劑 WizardTMDNA Clean－Up System為Promega公司產(chǎn)品；rTaq酶、PCR試劑、DNA Marker DL－2 000為TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；蛋白酶K為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1．3 蟲體DNA的提取 從－20℃的冰箱中取出70%酒精保存的蟲體，用純凈水反復(fù)吹打沖洗6次后，置于一新的1．5mL Eppendorf管中，用滅菌且經(jīng)紫外燈照射過(guò)的眼科剪刀將蟲體組織剪碎，然后加入200μL的GT buffer反復(fù)研磨，再加20μL蛋白酶K，混勻后，放于55℃培養(yǎng)箱中12～16h，其間搖動(dòng)數(shù)次，使蟲體組織裂解充分。將消化好的蟲體懸液按WizardTMDNA Clean－Up System 使用說(shuō)明書進(jìn)行蟲體DNA提取，將提取出的DNA于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank：HQ704901．1公布的序列，設(shè)計(jì)特異引物，序列如下：

NAD 4F：CTTATTATTTAATTTTTTATGCTGCT，

NAD 4R：AAGCGGCTAAAGCCTTAGCATCACT；

COX2F：TTTAAGTTTGTTGTATTATTATGGTTT，

COX2F：AAAATACACCAACCACAGGAAAACT；

引物由金思瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成。擴(kuò)增體系為25μL：雙蒸水15．25μL、10×PCR Buffer（Mg2＋free）2．5μL、MgCl2（25mmol／L each）4 μL、dNTPs（2．5mmol／L）2μL、上 游 引 物 （100 pmol／L）0．5μL、下游引物 （100pmol／L）0．5μL、Taqpolymerase（5U／μL）0．25μL、DNA 模板1 μL；反應(yīng)在Biometra循環(huán)反應(yīng)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s、57℃退火30s、72℃延伸30s，共37個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。取3μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0．9%TAE瓊脂糖凝膠電泳，用紫外投射儀觀察結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)攝像記錄。

1．5 pcox2和pnad4序列測(cè)定及其在種系發(fā)育分析中的應(yīng)用 將純化后的PCR產(chǎn)物送金思瑞生物科技有限公司直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar 5．0軟件進(jìn)行分析。從GenBankTM檢索代表性的蛔蟲pcox2序列和pnad4序列與之進(jìn)行相似性比對(duì)和蛔蟲種系發(fā)育分析，以雙盲小口線蟲（Contracaecum osculatum）作為外群。利用Clustal X1．81及 Mega 4．0軟件對(duì)pcox2和pnad4序列進(jìn)行比對(duì)及計(jì)算遺傳距離，然后用Phylip 3．67程序中的最大簡(jiǎn)約法（Maximum parasimony，MP）和 Mega 4．0程序中的臨接法（Neighbor－joining method，NJ）繪制種系發(fā)育樹，并用Puzzle 5．2程序構(gòu)建最大似然樹（Maximum Likelihood，ML）。臨接法在軟件默認(rèn)設(shè)置下進(jìn)行分析；最大簡(jiǎn)約法采用Branch and bound模型分析，采用自展檢驗(yàn)（bootstrap test）估算所構(gòu)建系統(tǒng)樹的可靠性，ML法采用Hky替代模型和Quartet puzzling搜索程序進(jìn)行分析，復(fù)制數(shù)均 為 1 000。 同 時(shí) 利 用 DNAStar 5．0 中 的MegAlign程序進(jìn)行相似性分析。

2 結(jié)果及分析

2．1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 12個(gè)樣品均成功地?cái)U(kuò)增出約350bp（pcox2）和400bp（pnad4）圖1的片段，與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度相符，且無(wú)非特異性條帶，空白對(duì)照為陰性。

2．2 測(cè)序結(jié)果及分析 測(cè)序結(jié)果顯示，由引物COX2和NAD4擴(kuò)增的雞蛔蟲pcox2和pnad4片段大小分別為290～310bp和340～360bp，對(duì)12條雞蛔蟲pcox2和pnad4序列進(jìn)行了種內(nèi)比較，結(jié)果顯示，12個(gè)不同個(gè)體間的pcox2和pnad4序列的差異為0．0%～2．0%和0．0%～3．3%；其樣品差異主要是存在堿基置換和顛換現(xiàn)象。12個(gè)分離株pcox2相差6bp、pnad4相差16bp；各長(zhǎng)沙分離株之間相應(yīng)pcox2序列的相似性在98%以上、pnad4序列相似性在96%以上。長(zhǎng)沙分離株與基因庫(kù)中其他蛔蟲pcox2序列的相似度均低于88% 、pnad4序列的相似度均低于79% 。從堿基組成來(lái)分析，12個(gè)分離株pcox2的G＋C含量最高為36．14%；A＋T含量最低為63．86%、pnad4的G＋C含量最高為31．48%；A＋T含量最低為68．52% 。

2．3 cox2和nad4序列系統(tǒng)發(fā)生樹 通過(guò)種系發(fā)育分析顯示，利用 Mega 4．1的 NJ法構(gòu)建了種系發(fā)育樹，長(zhǎng)沙分離株具有高度同源性（A1－3，B1－3，C1－3，D1－3），長(zhǎng)沙分離株位于同一分枝，系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap值較高，長(zhǎng)沙分離株所屬分枝與其他蛔蟲所屬分支相隔較遠(yuǎn)，得到了很好地鑒別見圖2。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，各湖南分離株之間相應(yīng)序列的相似性均在98%（COX2）和96%（NAD4）以上，湖南分離株與基因庫(kù)中其他蛔蟲相似度均低于88%（COX2）和79%（NAD4）。17個(gè)湖南分離株cox2和nad4序列種間的變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)的變異，說(shuō)明cox2和nad4均能為種間的遺傳變異提供遺傳標(biāo)記，可用于雞蛔蟲的鑒定。采用3種不同方法構(gòu)建的進(jìn)化樹具有一致性，均顯示出湖南分離株位于同一分枝，系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap值較高，與D．latum的關(guān)系最近。湖南分離株所屬分枝與其他蛔蟲所屬分支相隔較遠(yuǎn)，得到了很好地鑒別。本項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果表明，雞蛔蟲的cox2和nad4序列種內(nèi)相對(duì)保守，種間差異大，說(shuō)明cox2和nad4序列能作為雞蛔蟲的遺傳標(biāo)記用于雞蛔蟲的鑒定。本試驗(yàn)結(jié)果為雞蛔蟲的分類鑒定以及進(jìn)一步的分子流行病學(xué)調(diào)查和群體遺傳研究提供了基礎(chǔ)。

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