王貴強(qiáng)，孫莎莎，范 開，林德貴

（1．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193；2．北京生泰爾生物科技有限公司，北京 昌平102206）

白色念珠菌是一種人畜共患真菌病，能引起人和動(dòng)物內(nèi)臟、皮膚以及黏膜的感染［1］。西藥曾在白色念珠菌病的治療中發(fā)揮過(guò)舉足輕重的作用，但是，由于抗真菌藥的廣泛應(yīng)用，真菌對(duì)抗真菌藥物尤其是唑類藥物的耐受性逐漸增強(qiáng)，大量耐藥菌株的出現(xiàn)使得白色念珠菌病的治療越來(lái)越困難。而且，現(xiàn)有抗真菌藥存在的毒副作用一直未能解決。尋求一種更加安全可靠的途徑來(lái)解決真菌感染，已成為醫(yī)學(xué)界的強(qiáng)烈呼喚。

中藥治病在中國(guó)已有幾千年的歷史，我國(guó)科學(xué)家經(jīng)過(guò)幾十年的探索，發(fā)現(xiàn)許多中藥具有抗真菌作用，并分離得到了多種有效化學(xué)成分［2］。檸檬醛、肉桂醛、丁香酚具有較強(qiáng)的抗白色念珠菌作用，本試驗(yàn)將這3種藥物作用于耐藥型白色念珠菌菌株，通過(guò)電鏡觀察這3種藥物對(duì)白色念珠菌菌體的作用效果，并利用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC－MS）檢測(cè)白色念珠菌細(xì)胞膜甾醇合成的變化，來(lái)揭示這3種中藥提取物抑制白色念珠菌的機(jī)理。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)菌株 耐氟康唑白色念珠菌菌株（分離自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院并經(jīng)培養(yǎng)鑒定）。

1．2 藥物 檸檬醛、肉桂醛、丁香酚，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1．3 培養(yǎng)基 RPMI－1640液基，按 NCCLS［3］方案推薦方法配制。

1．4 抗真菌藥物稀釋液制備 將中藥提取物用二甲基亞砜（DMSO）根據(jù)不同藥物的溶解度不同進(jìn)行10倍或50倍溶解稀釋，再用RPMI－1640培養(yǎng)液進(jìn)行100倍稀釋，使DMSO的終濃度＜1%，經(jīng)對(duì)照試驗(yàn)該濃度DMSO對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

1．5 掃描電鏡樣品制備 將耐氟康唑白色念珠菌臨床分離株35℃活化24h，分別用64．0mg／L的檸檬醛、16．0mg／L 的肉桂醛和64．0mg／L的丁香酚作用12h；取未經(jīng)藥物處理的上述菌株孵育12h作為對(duì)照組。分別將各組菌體細(xì)胞洗滌離心3次，先后經(jīng)固定、脫水、臨界點(diǎn)干燥、裝臺(tái)粘膠及噴金處理后，通過(guò)掃描電鏡觀察［4］。

1．6 細(xì)胞膜甾醇成分分析－GC／MS檢測(cè)（氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用） 從SDA平板上挑取耐藥型白色念珠菌單克隆菌落接種于1mL RPMI－1640培養(yǎng)基，35℃，200r／min振蕩培養(yǎng)24h后，同樣條件下連續(xù)傳代2次，培養(yǎng)16h。分別取菌液1mL于含150 mL RPMI－1640培養(yǎng)液的250mL錐型瓶中，各加入檸檬醛、肉桂醛和丁香酚，使其終濃度分別為50．0mg／L、12．5mg／L、50．0mg／L，空白對(duì)照組不加藥。35℃，200r／min振蕩培養(yǎng)，時(shí)間不低于48 h，直至獲得足夠的菌量。2 000r／min離心5min，PBS洗滌3次至上清無(wú)色，棄上清，室溫風(fēng)干10 min后，分別稱取不同藥物作用后的白色念珠菌1．0g于50mL無(wú)塞玻璃管中，加PBS 5mL和新鮮制備的皂化劑12mL，混勻，80℃水浴皂化60min冷卻至室溫。加石油醚（沸程30℃～60℃）10mL，渦旋混勻1min，提取3次后合并提取液，加水10 mL渦旋混勻洗滌，移去水層。醚層在60℃水浴揮干，得未皂化脂，加環(huán)己烷0．9mL混勻后加封保鮮膜放置于4℃冰箱備用。

1．7 GS／MS參數(shù) 取上述提取的未皂化脂少量用于GC／MS檢測(cè)，具體檢測(cè)條件如下：（1）檢測(cè)儀器：Finnigan Voyager氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀。（2）色譜柱：VF－5ms石英毛細(xì)管柱（30m×0．25mm×0．25 mm）。（3）柱溫：200℃（保持2min）～300℃（保持15min）。（4）升 溫 速 度：20℃／min，汽 化 溫 度250℃。（5）載氣（流量）：He（1．0mL／min），分流比：15∶1，1．0μL樣品。（6）質(zhì)譜檢測(cè)器：EI源，電子能量70Ev，源溫200℃。（7）標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)：NIST庫(kù)2．3細(xì)胞膜甾醇成分分析結(jié)果

2 結(jié)果

2．1 掃描電鏡結(jié)果 經(jīng)過(guò)一定處理后，各組白色念珠菌菌體掃描電鏡結(jié)果（見圖1）。對(duì)照組，白色念珠菌菌體光滑完好，輪廓清晰（A）。檸檬醛組，可見菌體表面出現(xiàn)凹陷，空洞，菌體由橢圓形變得扁平（B）。肉桂醛組，菌體明顯損傷，出現(xiàn)變形、殘缺，甚至出現(xiàn)菌體碎片（C）。丁香酚組菌體未出現(xiàn)明顯變形或損傷，但菌體表面粗糙，附有大量異物（D）。

2．2 細(xì)胞膜甾醇成分分析結(jié)果 本試驗(yàn)采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用的方法檢測(cè)各種藥物處理后白色念珠菌甾醇成分的變化，初步探討了3種中藥提取物對(duì)麥角甾醇生物合成通路上的作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明，對(duì)照組（圖2）以麥角甾醇（b）為主峰，另有兩種細(xì)胞膜合成過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物角鯊烯（a）、羊毛甾醇（c）。經(jīng)過(guò)檸檬醛、肉桂醛、丁香酚處理后的白色念珠菌，麥角甾醇含量與對(duì)照組相比，分別變?yōu)閷?duì)照組的9．19%、33．49%、74．36%。同樣，羊毛甾醇的含量也出現(xiàn)了較大變化，檸檬醛組（圖3）峰面積顯著上升，占對(duì)照組面積的284．72%，肉桂醛組（圖4）占對(duì)照組109．32%，丁香酚組（圖2）占對(duì)照組111．69%。同時(shí)，檸檬醛組出現(xiàn)了新峰（d、g、f、h），肉桂醛組出現(xiàn)新峰（d、e）。我們由此可以得出結(jié)論，檸檬醛阻礙了白色念珠菌細(xì)胞膜上羊毛甾醇向麥角甾醇的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致麥角甾醇合成減少，而麥角甾醇的前體羊毛甾醇在真菌細(xì)胞內(nèi)大量積累，同時(shí)產(chǎn)生了大量的其他中間產(chǎn)物，從而發(fā)揮抑制耐藥型白色念珠菌的作用。肉桂醛組麥角甾醇的合成明顯減少，同時(shí)出現(xiàn)了（d、e）兩個(gè)新峰，但羊毛甾醇含量并未見明顯增加。檸檬醛組角鯊烯變?yōu)閷?duì)照組的94．97%，肉桂醛、丁香酚組角鯊烯均沒有出現(xiàn)明顯的藥峰。

3 討論

西藥治療真菌病已有幾十年的歷史，曾經(jīng)取得過(guò)輝煌的成績(jī)。白色念珠菌病是最為常見的真菌病之一，然而，現(xiàn)在臨床上出現(xiàn)了越來(lái)越多的耐氟康唑、酮康唑的白色念珠菌菌株［5］，使得傳統(tǒng)藥物的治療效果大大降低。中藥具有副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，且經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究，很多中藥抑菌、殺菌效果明顯。本試驗(yàn)即證實(shí)檸檬醛、肉桂醛對(duì)耐氟康唑白色念珠菌具有較好的抑制作用，并揭示了其抑菌機(jī)理。

電鏡研究結(jié)果顯示，經(jīng)檸檬醛作用后，耐藥型白色念珠菌表面出現(xiàn)了明顯的凹陷，菌體由原來(lái)的橢圓形變得扁平，菌體中間有空洞。而經(jīng)過(guò)肉桂醛作用后，白色念珠菌菌體出現(xiàn)明顯變形，甚至可以見到菌體碎片，這與之前檸檬醛、肉桂醛作用于白色念珠菌的研究基本一致，說(shuō)明檸檬醛、肉桂醛對(duì)耐藥型白色念珠菌同樣具有較好的破壞作用。氣相色譜－質(zhì)譜檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，檸檬醛組細(xì)胞膜麥角甾醇含量顯著降低，同時(shí)羊毛甾醇含量急劇上升。因麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的特有成分，麥角甾醇缺乏以及甾醇前體累積會(huì)導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜的破裂［6］，由此我們推測(cè)，檸檬醛可能阻斷了白色念珠菌細(xì)胞膜上羊毛甾醇到麥角甾醇的合成，使得羊毛甾醇大量積累，麥角甾醇合成顯著減少，導(dǎo)致了白色念珠菌細(xì)胞膜的破壞。同時(shí)其他藥峰的出現(xiàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證藥物阻斷了羊毛甾醇到麥角甾醇合成通路，導(dǎo)致中間產(chǎn)物大量積累，具體中間產(chǎn)物成分如何，還需要進(jìn)一步研究。肉桂醛對(duì)白色念珠菌細(xì)胞膜甾醇成分亦有較大影響，主要是導(dǎo)致麥角甾醇含量顯著降低，我們由此可以推測(cè)，肉桂醛發(fā)揮抑菌作用的機(jī)制可能是直接與細(xì)胞膜上的麥角甾醇發(fā)生作用，從而破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性，達(dá)到抑制白色念珠菌的目的。

因麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的獨(dú)特組成成分，而檸檬醛、肉桂醛對(duì)其有著非常有效的作用效果，能大量減少麥角甾醇的合成。因此，我們認(rèn)為，檸檬醛和肉桂醛作為抗真菌藥有很大的研發(fā)前景。

［1］ Barnes R A，Denning D W，Evans E G，etal．Fungal infections：a survey of laboratory services for diagnosis and treatment［J］．Commun Dis Rep CDR Rev，1996，6（5）：69－75．

［2］ 夏忠弟，楊軍祥，李沛濤．山蒼子油抗白色念珠菌的機(jī)制研究［J］．湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，20：107－108．

［3］ National Committee For Clinical Laboratory Standard．Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast［J］．Tentative standard M 27－T．Pennsylvania：NCCLS，1995，1－22．

［4］ 謝小梅，龍 凱，方建茹，等．肉桂醛、檸檬醛抑制黃曲霉生長(zhǎng)機(jī)制研究［J］．中國(guó)公共衛(wèi)生，2007，23（3）：301－302．

［5］ Rosenbiatt H M，Byrne W，Arnent M E，etal．Successful treatment of chronic mucocutaneoous candididesis with ketoconazole［J］．J Pediatr，1980，97（4）：657．

［6］ White T C，Marr K A and Bowden R A．Clinical，cellular，and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance［J］．Clin Microbiol Rev，1998，11（2）：382－402．